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反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌的研究

作　者: 曹峰子
导　师: 宋勤叶；陈小玲
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 反向斑点杂交 23S rRNA基因 致病基因 寡核苷酸 反向PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 32次
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内容摘要


当前传染病的发病特点是多病原混合感染增多,使病情复杂化,增加了临床诊断的难度。快速﹑灵敏﹑准确﹑特异性检测猪的致病菌是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。本文的研究目的是建立针对猪的多种致病菌的基因芯片检测技术平台,为临床诊断提供快速﹑有效的诊断手段。从美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库中下载了大肠杆菌K88基因序列并设计了一条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和一对报告基因的反向PCR引物。并将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25-30 bp探针加长到30-38 bp,两对通用引物序列不变,用地高辛取代荧光标记下游引物,用尼龙膜取代玻片为载体制备膜芯片,检验了探针/膜杂交的特异性和敏感性。在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向PCR引物对,被检样品扩增后做膜杂交。修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交;膜杂交的最小检出量为100 fg DNA,均与玻片芯片接近。对5个参考菌株和34个野外分离株的检测准确率为35/39 (89.7%) ,也与玻片芯片接近。在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。建立的反向斑点杂交方法简便快速,可用于仪器设备不足的实验室和低成本检测,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片之诊断能力。本研究可能为临床诊断提供一个有用的平台。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 引言  10-18
  1.1 目标细菌及鉴定方法的简要介绍  10-12
  1.2 基因芯片介绍  12-14
    1.2.1 探针的性质  12-13
    1.2.2 目标基因  13-14
    1.2.3 基因芯片的片基  14
  1.3 实验中用到的TAG-ARRAY 技术简述  14-16
    1.3.1 Tag-Array 原理  14-15
    1.3.2 ssPCR 的操作步骤  15-16
  1.4 研究目的与意义  16-17
  1.5 技术路线  17-18
第二章 大肠杆菌毒力基因K88 探针与报告基因的设计  18-23
  2.1 材料与方法  18-20
    2.1.1 主要试剂  18
    2.1.2 主要仪器  18
    2.1.3 大肠杆菌毒力基因K88 探针的设计  18-19
    2.1.4 报告基因的设计  19
    2.1.5 报告基因成环  19
    2.1.6 报告基因反向PCR 通用引物的设计  19
    2.1.7 23S rRNA 加长探针的设计  19-20
  2.2 结果  20-21
    2.2.1 大肠杆菌K88 毒力基因特异性探针设计  20
    2.2.2 报告基因  20
    2.2.3 用于制备斑点杂交的探针  20-21
  2.3 分析与讨论  21-23
第三章 检测样本与斑点杂交膜片的制备  23-28
  3.1 材料与方法  23-25
    3.1.1 菌种  23
    3.1.2 主要试剂  23
    3.1.3 主要仪器设备  23-24
    3.1.4 基因组DNA 模板的提取  24
    3.1.5 多重PCR 扩增目的片段  24
    3.1.6 杂交膜片的制备  24-25
  3.2 结果  25-27
    3.2.1 三重PCR 反应体系和程序的建立  25-26
    3.2.2 斑点杂交膜探针矩阵  26-27
  3.3 讨论  27-28
第四章 膜斑点杂交及其性能评价  28-34
  4.1 材料与方法  28
    4.1.1 主要试剂  28
    4.1.2 主要仪器  28
  4.2 膜杂交程序  28-30
    4.2.1 预杂交和杂交  28-29
    4.2.2 洗膜  29
    4.2.3 检测杂交信号  29
    4.2.4 膜斑点杂交的性能评价  29-30
  4.3 结果  30-32
    4.3.1 探针的特异性验证  30
    4.3.2 膜斑点杂交检测技术的灵敏度  30-31
    4.3.3 膜斑点杂交技术可以同时检测多个不同样本  31
    4.3.4 膜杂交检测技术的临床应用  31-32
  4.4 讨论  32-34
讨论  34-35
结论  35-36
参考文献  36-39
在读期间发表的学术论文  39-40
作者简介  40-41
致谢  41-42

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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