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拮抗蓖麻毒素小分子化合物的虚拟筛选和生物活性评价

作　者: 曹曦元
导　师: 冯健男；彭晖
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 蓖麻毒素蓖麻毒素A链计算机辅助药物设计虚拟筛选小分子抑制剂蛋白相互作用
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蓖麻毒素(ricin)是从植物蓖麻子中分离得到的一种Ⅱ型核糖体失活蛋白,分为A链(RTA)和B链(RTB),其A链(RTA)为效应链,具有N-糖苷酶活性,通过催化28S rRNA S/R结构域第4324位脱去一个保守的腺嘌呤,使核糖体60S亚基失活,从而阻断蛋白质合成途径引起细胞死亡。因其高毒性、原料易得、提取简便和高度稳定性,容易被恐怖组织利用制造恐怖袭击。疾病防控中心将其列为生物恐怖级别B类,目前临床上还没有针对ricin的解毒药。因此,关于蓖麻毒素的拮抗剂的研究就显得意义重大。具体研究内容概括如下：1.基于RTA复合物晶体结构虚拟筛选小分子拮抗化合物根据RTA复合物的晶体结构特征,利用自主开发的可通过商业购买的、含有～200,000个有机小分子三维结构数据库进行DOCK筛选。基于相互作用能打分模式对RTA-小分子化合物结合能力进行理论评估,将得分靠前的2000个化合物利用聚类分析的方法分到结构不同的组中。根据其物化性质、化学稳定性、潜在的毒性等,从不同化合物组中选取最佳的61个化合物进行生物活性测试。利用兔网织红细胞裂解液蛋白合成体系实验,从分子水平探讨选取的61个化合物抑制RTA的毒性作用；进而选择对RTA敏感的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞,从细胞水平分析化合物拮抗RTA的生物学功能,以此评估筛选先导化合物的活性。其中第21、29、38、52、60号化合物以及阳性对照PTA有明显的拮抗作用,由于29号化合物的拮抗作用最好以及良好的类药性,最终被确定为先导化合物。2.29号衍生物的优化和活性评价以29号先导化合物为骨架,针对化合物三维结构数据库进行构象相似性搜索，最终优化确定出84个衍生物。无细胞体系和细胞毒实验表明,第18、50、52、55、57、68号衍生物有明显的拮抗作用,而且有剂量依赖效应。其中55号衍生物的拮抗效果比29号先导化合物要好,最终确定55号衍生物为候选化合物。3.rRTA突变体的构建及活性评价通过分子对接、力学优化获得了RTA与小分子化合物相互作用的复合物结构。进一步利用距离几何学、分子间氢键以及静电作用合理预测小分子识别rRTA的关键氨基酸残基：Arg48,Asn78,Tyr80,Val81,Gly121,通过分子生物学实验对RTA关键氨基酸进行Ala单点突变。将丙氨酸突变体进行构建,并表达和纯化其蛋白。在无细胞体系和细胞毒实验进行突变体毒性评价。其中Arg48,Asn78,Tyr80突变体对蛋白合成抑制作用减弱,表明这几个氨基酸残基对rRTA活性起着关键作用。其中,我们首次研究报道Arg48为参与小分子与ricin相互作用的重要氨基酸。4.用蛋白相互作用仪器测定rRTA和29号先导化合物及其衍生物的亲和力用ForteBio蛋白作用仪器检测29号先导化合物及其衍生物对rRTA蛋白的结合和解离反应,由此获得上述化合物和rRTA结合的动力学常数。测定结果表明29号和55号衍生物与rRTA的亲和力常数分别9.23E-07和5.14E-07,均好于PTA。本研究通过基于RTA靶点的虚拟筛选和生物活性评价,确定了拮抗rRTA生物学功能的先导小分子化合物,并进行了优化。同时建立的快捷、敏感、稳定、定量的生物学评价平台,为进一步防治蓖麻毒素中毒打下坚实基础。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-17
第一部分拮抗ricin先导化合物的虚拟筛选  17-35
  一、计算机辅助设计拮抗RTA先导化合物  17-20
    1 材料与方法  17-19
    2 结果  19-20
    3 讨论  20
  二、拮抗RTA小分子先导化合物的生物功能学评价  20-34
    1 材料与方法  20-23
    2 结果  23-31
    3 讨论  31-34
  小结  34-35
第二部分拮抗ricin第29号化合物衍生物的设计和筛选  35-44
  一、计算机辅助设计拮抗RTA衍生物  35-36
    1 材料与方法  35
    2 结果  35-36
    3 讨论  36
  二、拮抗RTA衍生物的生物功能学评价  36-43
    1 材料与方法  36
    2 结果  36-41
    3 讨论  41-43
  小结  43-44
第三部分 rRTA突变体的构建以及活性评价  44-51
  一、rRTA突变体构建  44-48
    1 材料与方法  44-47
    2 结果  47-48
    3 讨论  48
  二、rRTA突变体的活性评价  48-50
    1 材料与方法  48-49
    2 结果  49-50
    3 讨论  50
  小结  50-51
第四部分用蛋白相互作用仪器评价小分子化合物和rRTA相互作用  51-55
  一、小分子化合物和rRTA相互作用  51-54
    1 材料与方法  51-53
    2 结果  53
    3 讨论  53-54
  小结  54-55
总结  55-56
参考文献  56-60
文献综述  60-66
发表文章  66-70
个人简历  70-71
致谢  71

拮抗蓖麻毒素小分子化合物的虚拟筛选和生物活性评价

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