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猪链球菌2型1358hk组氨酸激酶抑制剂筛选

作　者: 胡进
导　师: 陈焕春；贝为成
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型酶动力学分析同源模建虚拟筛选
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细菌双组份调控系统(Two-component regulatory system, TCS)是细菌感应外界复杂环境,维持自身存活和生长繁衍的重要感应和调控系统。1358hk/rr双组份调控系统是猪链球菌2型(S.suis2, SS2)15对TCS其中一对,在其它细菌中也普遍存在。通过序列比对发现,猪链球菌2型1358hk/rr与肺炎链球VicK/R同源性较高,氨基酸序列一致性81%。目前研究发现,在肺炎链球菌中将VicK组氨酸激酶基因缺失后,发现它的生长、生物膜的形成、细菌链的增长减慢及毒力降低,因此,认为其对肺炎链球的生长是必需的。我们通过大量的工作筛选1358hk/rr TCS的基因缺失突变株,但一直没有获得突变株,推测1358hk/rr也可能影响猪链球2型的生长或存活。目前,已有针对肺炎链球菌及表皮葡萄球菌的组氨酸激酶YycG进行同源模建,然后在化合物库中筛选有效的抑制剂的文章,而国内外还没对猪链球菌2型的研究报道。因此,我们想通过对猪链球菌2型的组氨酸激酶1358(1358hk)进行同源模建后,虚拟筛选出针对该靶点的能抑制猪链球菌2型生长的先导抑制剂。主要研究内容如下：1.猪链球菌2型组氨酸激酶(1358hk)的同源模建和分析在运用同源模建的的方法构建1358蛋白的三维结构的基础上,用Procheck软件对此结构模型的可靠性进行验证,结果显示猪链球菌2型组氨酸激酶1358与PDB编号为3DGE的Thermotoga maritima X晶体衍射结构(分辨率2.8 ?)具有31%的一致性；模建后的1358结构能与模板很好的叠合；结果显示：模建的猪链球菌2型组氨酸激酶1358达到了要求,该模型可以用于分子对接,进而进行抑制剂先导化合物的筛选。2.猪链球菌2型组氨酸激酶(1358hk)先导抑制剂的虚拟筛选我们通过采用FlexX对SPECS小分子数据库初步的筛选,评分较高的化合物得到选择；再采用Xscore程序进行打分,获得一定数量的化合物；接下来得到108个化合物是通过类药性分析筛选；最后采用FlexX及经验进行人工挑选。通过在化合物数据库中进行四次不同的筛选,我们最终从SPECS数据库中得到了40个小分子化合物,并通过购买进行试验。3.猪链球菌2型组氨酸激酶(1358hk)功能域片段(1358’)的克隆、表达、纯化及活性鉴定猪链球菌2型组氨酸激酶1358是一个跨膜蛋白,因此我们通过截短其胞内的HATPase c激酶功能域片段(1358’)进行表达。通过PCR扩增猪链球菌2型1358跟ATP结合的那一部分DNA序列,本实验的重组质粒是通过pET28a载体构建。重组质粒转入表达菌株BL21后,通过加入IPTG诱导表达4h,破碎并用SDS-PAGE鉴定表达的目的蛋白,纯化的1358’蛋白采用荧光激酶检测试剂盒检测的酶活性。最后我们得到1358’大约为35kDa的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与ATP反应。4.先导化合物的抑酶试验通过建立酶动力学分析,初步对在SPECS小分子化合物库中对接虚拟筛选并购买获得的40个化合物,利用激酶试剂盒进行初步筛选,得到每个化合物抑制激酶蛋白分解ATP的抑制率；结果显示化合物1在化合物浓度在500μM/L的抑制率达到66%,化合物浓度降到100μM/L的抑制率为50%,但没有抑制猪链球菌2型生长的效果。其它的化合物抑制率相对化合物1较低,有些化合物在降低浓度后抑制率反而上升,说明这几种化合物在DMSO中的溶解度不是很好。从而得出我们筛选的化合物在较低浓度条件下能抑制1358’酶蛋白活性,为进一步筛选出抗菌的新型药物提供实验依据。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词  10-11
1 文献综述  11-16
  1.1 猪链球菌病的危害  11
  1.2 猪链球菌病的发病机制  11-13
  1.3 细菌双组份调控系统与细菌毒力的关系  13-14
  1.4 双组份调控系统做为抗菌药物治疗靶点  14
  1.5 VicRK做为药靶的应用与其展望  14-16
2 研究的目的和意义  16-17
3 材料与方法  17-25
  3.1 材料  17-19
    3.1.1 实验所用的菌株、质粒和培养条件  17
    3.1.2 酶、试剂和试剂盒  17-18
    3.1.3 培养基、抗生素及其配制  18
    3.1.4 PCR引物  18-19
    3.1.5 序列的来源  19
  3.2 方法  19-25
    3.2.1 分子生物学基本的操作方法  19
    3.2.2 1358hk激酶功能域的序列分析及克隆表达  19-23
    3.2.3 同源序列搜索,模板选择  23
    3.2.4 建立模型,模型评价  23
    3.2.5 ADP与1358'分子对接  23-24
    3.2.6 准备筛选中的小分子数据库  24
    3.2.7 结合计算机模拟,进行1358HATPase_c的定点突变  24-25
4 结果与分析  25-39
  4.1 1358hk激酶功能域的序列分析  25-27
    4.1.1 PCR扩增1358基因  25-26
    4.1.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化  26-27
  4.2 1358hk激酶活性测试及酶动力学分析  27-29
  4.3 序列对比结果  29-30
  4.4 1358模型结果及结构特征分析  30-32
  4.5 分子对接及化合物筛选分析  32-33
  4.6 猪链球菌2型组氨酸激酶1358蛋白活性位点处残基与底物ADP的相互作用  33-34
  4.7 体外酶抑制剂的筛选及抑菌的结果  34-36
  4.8 猪链球菌2型组氨酸激酶1358蛋白活性位点处关键的氨基酸残基定点突变结果  36-39
    4.8.1 突变蛋白原核表达载体的构建及鉴定  36-38
    4.8.2 突变蛋白的表达  38-39
5 讨论  39-42
  5.1 选择1358hk激酶功能域做药物靶标的依据  39
  5.2 选用1358hk激酶功能域分析及克隆表达的原因  39-40
  5.3 初步利用激酶试剂盒初步建立1358hk激酶功能域的酶动力学的分析  40
  5.4 通过同源建模并利用SYBYL7.3中FlexX软件进行对接的依据  40
  5.5 结合计算机模拟,进行1358HATPase_c的定点突变的原因  40
  5.6 对筛选化合物抑酶和抑菌效果的分析  40-42
6 结论  42-43
参考文献  43-47
致谢  47

猪链球菌2型1358hk组氨酸激酶抑制剂筛选

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