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鸡马立克氏病病毒CVI988/Rispens细菌人工染色体的构建

作　者: 董鹏
导　师: 王云峰
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病病毒细菌人工染色体 MDV CVI988/Rispens
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起的鸡的一种高度接触传播的淋巴组织增生性肿瘤疾病。该病在历史上曾对养禽业造成了沉重的打击,自上世纪70年代起利用弱毒疫苗对鸡实施免疫接种起,才得以被控制,但由于MDV的毒力在不断地增强,对现有的免疫策略提出了严竣的挑战。MDV为疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科双链DNA病毒,分3种血清型,只有血清1型致病。其中CVI988/Rispens是一个人工培育的MDV-1低毒力株,CVI988/Rispens株疫苗是目前全球用以控制MD使用最多且免疫效果最好的弱毒活疫苗。深入研究MDV基因结构功能及调控机制,是有效防控MD的前提。但MDV庞大的基因组,严格的细胞结合性的特点,传统的基因操作技术对其研究十分困难,利用细菌人工染色体技术构建MDV全长基因组的感染性克隆成为对MDV基因进行操作的一个有力工具。本研究首先利用自主构建的重组病毒转移载体pUA1B1-gpt-BAC和MDV CVI988 (Rispens)株感染细胞总基因组共转染鸡成纤维细胞(CEF),启动病毒感染后,在选择培养基的选择加压筛选条件下,经六轮筛选、富集并完全纯化了重组病毒;BAC重组病毒与亲代病毒体外生长的蚀斑形态和生长动力学曲线无明显差异,初步表明载体的插入没有改变病毒体外生长的生物学特性。适时提取重组病毒感染CEF细胞的总DNA,电转化导入大肠杆菌DH10B,挑取阳性克隆经鉴定获得了37个BAC分子克隆化病毒。选取10个BAC分子克隆化病毒经过初步PCR鉴定为全基因组BAC分子克隆化病毒。本研究成功构建了鸡马立克氏病病毒CVI988/Rispens株全基因组分子克隆化病毒,为建立鸡马立克氏病病毒CVI988/Rispens株的反向遗传操作技术平台奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-29
  1.1 MDV 研究简述  13-23
    1.1.1 MD  13-14
    1.1.2 MDV 形态学特征  14
    1.1.3 分子生物学特征  14-17
    1.1.4 马立克氏病病毒主要的致瘤相关基因  17-19
    1.1.5 MDV 的致病机理  19-20
    1.1.6 MD 疫苗及防控  20-23
  1.2 细菌人工染色体技术  23-26
    1.2.1 BAC 载体系统简述  23-24
    1.2.2 BAC 载体修饰技术  24-26
  1.3 MDV 细菌人工染色体研究进展  26-28
    1.3.1 MDV BAC 技术  26
    1.3.2 MDV BAC 构建策略  26-27
    1.3.3 MDV BAC 研究进展  27-28
  1.4 本研究的目的和意义  28-29
第二章 MDV CVI988 细菌人工染色体重组病毒转移载体的构建  29-35
  2.1 材料  29
    2.1.1 质粒、菌种、病毒与试剂  29
    2.1.2 主要仪器  29
  2.2 方法  29-32
    2.2.1 MDV CVI988 株感染细胞总 DNA 的提取  29-30
    2.2.2 MDV CVI988 重组病毒转移载体同源臂及加压筛选标记基因的扩增  30
    2.2.3 BAC 载体核心序列片段的制备  30-31
    2.2.4 重组病毒转移载体 pUA1B1-gpt -BAC 的构建  31-32
  2.3 结果  32-33
    2.3.1 转移载体同源臂及筛选标记基因的鉴定  32-33
    2.3.2 重组病毒转移载体 pUA1B1-gpt-BAC 的鉴定  33
  2.4 讨论  33-35
    2.4.1 pUA1B1-gpt-BAC 重组病毒转移载体插入位点的选择  33
    2.4.2 BAC 载体基本功能基因的完整性的重要性  33
    2.4.3 重组病毒转移载体 pUA1B1-gpt-BAC 中的两个 LoxP 的重要意义  33-35
第三章 MDV CVI988 株重组病毒的构建  35-42
  3.1 材料  35-36
    3.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂  35
    3.1.2 主要设备与仪器  35-36
  3.2 方法  36-39
    3.2.1 电转化转移载体质粒 pUA1B1-gpt-BAC 到 DH10B 宿主菌  36-37
    3.2.2 转移载体 pUA1B1-gpt-BAC 质粒的提取和纯化  37
    3.2.3 MDV CVI988 感染细胞总 DNA 的制备  37
    3.2.4 转移载体质粒与 Total-DNA 的共转染  37-38
    3.2.5 重组病毒rv-MDV CVI988 的获得  38
    3.2.6 重组病毒rv-MDV CVI988 的鉴定  38-39
  3.3 结果  39-41
    3.3.1 转移载体与病毒感染细胞总 DNA 的共转染获得重组病毒  39
    3.3.2 重组病毒 BAC 功能区的 PCR 鉴定结果  39-40
    3.3.3 重组病毒rv-BAC-MDV CVI988 与野生病毒wt-MDV CVI988 体外生长曲线的比较  40-41
  3.4 讨论  41-42
    3.4.1 MDV 感染细胞总 DNA 中 MDV 基因组完整性的意义  41
    3.4.2 用gpt 做筛选标记是获得重组病毒的关键  41-42
第四章 BAC 分子克隆化病毒的获得  42-51
  4.1 材料  42
    4.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂  42
    4.1.2 设备与仪器  42
  4.2 方法  42-47
    4.2.1 大肠杆菌 DH10B 感受态细胞的制备  42
    4.2.2 重组病毒感染 CEF 细胞总 DNA 的提取  42-43
    4.2.3 电转化筛选pBAC-CVI988 转化子  43
    4.2.4 pBAC-CVI988 转化子的初步鉴定  43
    4.2.5 pBAC-CVI988 BAC 的 PCR 鉴定  43-47
  4.3 结果  47-49
    4.3.1 电转化筛选 BAC 转化子  47
    4.3.2 pBAC-CVI988 中 BAC 序列的 PCR 鉴定结果  47-48
    4.3.3 pBAC-CVI988 中病毒基因组的 PCR 鉴定结果  48-49
  4.4 讨论  49-51
    4.4.1 重组病毒感染细胞总 DNA 提取时机的掌握  49
    4.4.2 电转条件的优化  49-50
    4.4.3 重组病毒的细胞总 DNA 和 BAC 转化子质粒的凝胶电泳  50
    4.4.4 BAC 分子克隆化病毒的拯救  50-51
第五章全文结论  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
作者简历  58

鸡马立克氏病病毒CVI988/Rispens细菌人工染色体的构建

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