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鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因的真核表达及其特异性单克隆抗体的研制

作　者: 刘明亮
导　师: 秦爱建
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡马立克氏病病毒,RB1B pp38基因 真核表达 间接免疫荧光 单克隆抗体
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


根据Genbank发表资料,设计了一对引物,应用PCR方法扩增出鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因,将PCR产物克隆到pGEM-T easy载体,经限制性酶切分析和测序证实扩增到的pp38基因序列完全正确。用BamHⅠ和PstⅠ酶将该基因片段从pGEM-T easy载体切下,回收目的DNA片段并与杆状病毒转座载体pFastBac 1连接,筛选出重组转座载体pFastBac 1- pp38,转座含有杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后,获得重组穿梭质粒rBacmid-pp38;将重组质粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得了含有鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38基因的重组杆状病毒rBacmid- pp38 ( r pp38 )。重组病毒感染Sf9细胞后,用IFA方法对细胞表达产物进行检测,结果表明:构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38蛋白。将表达鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B pp38蛋白的昆虫细胞免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。用丙酮乙醇固定液固定的感染了鸡马立克氏病病毒超强毒株RB1B的鸡成纤维细胞CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测杂交瘤细胞培养上清,结果筛选出1株分泌抗MDV-PP38蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为pp38-2F6,经2次亚克隆后,100%杂交瘤细胞保持了分泌抗体的能力。间接免疫荧光试验证明,这一株单克隆抗体能与MDV-RB1B以及MDV-CVI988感染的CEF反应,应用捕获ELISA方法进行的亚类鉴定结果表明:单抗2F6为IgG2b,此单抗将可以广泛用于体外表达系统表达pp38基因的鉴定和功能的深入研究。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
文献综述  7-28
研究内容  28-52
  第一章 鸡马立克氏病病毒超强毒株R818 pp38 基因在昆虫细胞中的表达  28-43
    1 材料与方法  29-36
    2 结果  36-39
    3 讨论  39-40
    参考文献  40-43
  第二章 抗鸡马立克氏病病毒超强毒株R818 pp38 蛋白特异性单克隆抗体的研制  43-52
    1 材料与方法  44-47
    2 结果  47-49
    3 讨论  49-50
    参考文献  50-52
成果小结  52-53
致谢  53-54

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