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表达新城疫病毒ZJ1株F基因的重组马立克氏病毒的构建

作　者: 王郁杨
导　师: 吴艳涛；刘秀梵
学　校: 扬州大学
专　业: 微生物学
关键词: 新城疫病毒马立克氏病病毒融合蛋白同源重组免疫效力
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

新城疫(Newcastle disease,ND)和马立克氏病(Marek’s disease,MD)是两种危害养禽业的重要病毒性传染病。本研究利用马立克氏病毒(MDV)Rispens CVI988疫苗毒株为载体,表达新城疫病毒(NDV)基因Ⅶ型流行毒株ZJ1的融合蛋白(F),构建针对ND和MD的多价重组疫苗。以MDV Rispens CVI988毒株基因组短独特区的sorf 1和sorf 2基因作为插入位点,选择网状内皮增生症病毒(REV)基因组的长末端重复序列(LTR)作为启动子,构建含NDV ZJ1毒株F基因及报告基因(smGFP)的转移载体质粒pMDV/F/GFP。将MDV感染细胞的DNA和转移载体质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经同源重组获得重组病毒。再通过筛选和纯化,得到重组病毒rMDV-F/GFP。然后,用Cre重组酶去除重组病毒基因组中的报告基因,得到仅带LTR启动子和F基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-F。经PCR、间接免疫荧光(IFA)试验证明, F基因已正确插入到MDV基因组中并得以表达。在CEF上连续培养7代后获得的rMDV-F,经PCR和IFA试验证实,仍具有良好的遗传稳定性。我们还评价了重组病毒rMDV-F对ND和MD的实验室免疫保护效力。在第1批试验中,以3000PFU的rMDV-F免疫一组1日龄SPF鸡,以0.2ml /鸡的灭活苗免疫另一组7日龄SPF鸡,另设攻毒对照组和空白对照组;在21日龄用10LD50的NDV F48E8强毒株进行攻击,rMDV-F免疫组保护率为83.33%,灭活苗免疫组保护率为100%,攻毒对照组的鸡全部发病死亡,空白对照组的鸡全部存活。在第2批试验中,以3000PFU的rMDV-F免疫一组1日龄SPF鸡,以同样剂量的MDV Rispens CVI988毒株免疫另一组1日龄SPF鸡,另设攻毒对照组和空白对照组;在7日龄以500PFU的MDV RB1B超强毒株攻击,观察至90日龄,对所有试验鸡进行剖检和组织学检查;rMDV-F免疫组与MDV Rispens CVI988免疫组对MD的保护率均为100%,攻毒对照组鸡均发病,空白对照组的鸡全部存活。试验表明,重组病毒rMDV-F免疫鸡对NDV强毒攻击有一定的抵抗作用,而对MDV强毒攻击能产生足够的保护力。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
符号说明  9-11
综述：重组马立克氏病毒研究进展  11-16
试验研究：表达 NDV ZJ1 株 F 基因的重组 MDV 的构建  16-35
  1 材料  17-18
    1.1 质粒和菌株  17
    1.2 疫苗株、病毒及鸡胚  17
    1.3 主要试剂  17-18
    1.4 主要仪器  18
    1.5 分子生物学软件  18
  2 方法  18-26
    2.1 转移载体质粒pMDV/F/GFP 的构建  18-22
    2.2 重组病毒的构建及其纯化  22-26
  3 结果  26-32
    3.1 NDV F 基因的克隆及鉴定  26
    3.2 MDV 基因组的外源基因插入位点两侧序列的获取  26-27
    3.3 含启动子LTR 及标记基因GFP 片段的获取  27
    3.4 转移载体质粒pMDV/F/GFP 的鉴定  27-28
    3.5 转移载体和MDV 感染细胞DNA 共转染CEF  28-29
    3.6 重组病毒rMDV-F 的鉴定  29-30
    3.7 重组病毒的稳定性  30-31
    3.8 重组病毒的免疫效力  31-32
  4 讨论  32-35
总结  35-36
参考文献  36-40
致谢  40-41
攻读学位期间发表的论文情况  41

表达新城疫病毒ZJ1株F基因的重组马立克氏病毒的构建

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