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鸡马立克氏病病毒超强毒L-ZY株细菌人工染色体的构建

作　者: 李继松
导　师: 王云峰
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病病毒细菌人工染色体感染性克隆
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒(MDV)引起的淋巴细胞肿瘤性疾病,在全世界范围内曾给养鸡业造成极大的经济损失。从20世纪50年代开始至今人们依次用火鸡疱疹病毒(HVT)、HVT与MDV血清Ⅱ型联用、MDV血清Ⅰ型弱毒株疫苗来接种雏鸡,获得了很好的免疫保护,使该病得到了很好的控制。但是到20世纪90年代后期,新出现的MDV超超强毒已经能够突破疫苗的免疫保护屏障,在免疫鸡群中引发MD。MDV L-ZY毒株是2006在我国东北地区分离的MDV超强毒株,可导致70%HVT免疫鸡群发生MD,与近年在国内分离的几个超强毒株亲缘关系较近,具有一定的地方流行性和代表性。超强毒株的出现为人们防控MD带来了新的挑战,研究MDV的致病机理和疫苗免疫保护机理对于防控MD有着非常重要的意义。MDV是严格的细胞结合毒,难于对病毒直接进行基因水平上的操作,最近出现的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)技术成功地解决了这一难题,本研究就是利用BAC技术构建MDV超强毒L-ZY毒株细菌人工染色体感染性克隆。首先,利用黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)基因表达盒,带有细菌人工染色体基本基因功能序列(pBeloBAC11,7.5kb)及MDV Us2区左右同源臂成功构建了含有两个相同序列方向loxP位点的MDV重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11,并且两个相同序列方向loxP位点分别位于BAC-gpt核心序列两侧,以保证选择标记基因和BAC序列在不需要时进行删除。转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11经酶切、PCR鉴定和两个loxP位点间序列的剪切测试完全正确。利用同源重组的方法,运用磷酸钙转染技术,将提取并纯化的转移载体与MDV感染CEF细胞的总DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF),待启动病毒感染后,利用GPT加压筛选标记,通过改进的加压筛选方法,经过6轮的加压筛选富集并获得了Us2区插入miniF核心序列的L-ZY BAC重组病毒。适时提取L-ZY BAC重组病毒感染细胞基因组总DNA,将其电转入DH10B感受态细胞中,获得L-ZY BAC(鸡马立克氏病病毒L-ZY株全基因组细菌人工染色体),经过PCR、凝胶电泳鉴定总共获得21个阳性克隆。将提取纯化的L-ZY BAC21转染次代CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了纯系重组病毒——derived-MDV LZY21。本研究成功构建了MDV血清Ⅰ型超强毒L-ZY株细菌人工染色体,从而完善了MDV细菌人工染色体反向遗传操作系统技术平台,为研究MDV的致瘤机制、潜伏机制、基因功能以及新型MDV疫苗的开发奠定了良好的基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章引言  13-22
  1.1 MDV研究综述  13-18
    1.1.1 MD和MDV  13-14
    1.1.2 MDV Ⅰ型病毒的致病机理  14-15
    1.1.3 MDV Ⅰ型病毒主要毒力基因的功能  15-18
  1.2 细菌人工染色体技术与疱疹病毒基因功能研究  18-19
  1.3 Cre/loxP重组酶修饰系统  19-20
    1.3.1 Cre/loxP重组酶修饰系统简介  19-20
    1.3.2 Cre/loxP重组方式  20
  1.4 本研究的目的和意义  20-22
第二章 MDVL-ZY株细菌人工染色体重组病毒转移载体构建  22-34
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 质粒、菌种、病毒与试剂  22-23
    2.1.2 主要仪器  23-24
  2.2 方法  24-29
    2.2.1 马立克氏病超强毒株L-ZY株的培养  24
    2.2.2 L-ZY重组病毒转移载体同源臂及加压筛选标记基因的PCR扩增  24-25
    2.2.3 BAC载体基本功能基因片段的制备  25
    2.2.4 pUAloxPB质粒构建  25-26
    2.2.5 pUAloxPB-gpt质粒构建  26-27
    2.2.6 重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11的构建  27-28
    2.2.7 pUAloxPB-gpt-BAC11载体loxP位点体外功能鉴定  28-29
  2.3 结果  29-33
    2.3.1 转移载体同源臂及gtp筛选标记基因的鉴定结果  29-30
    2.3.2 pUAloxPB质粒鉴定结果  30
    2.3.3 pUAloxPB-gpt质粒构建及鉴定  30-31
    2.3.4 重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11的鉴定  31-32
    2.3.5 pUAloxPB-gpt-BAC11两个loxP位点体外功能鉴定结果  32-33
  2.4 讨论  33-34
    2.4.1 pUAloxPB-gpt-BAC11重组病毒转移载体的通用性  33
    2.4.2 BAC载体基本功能基因的完整性是确保BAC形成的重要环节  33-34
第三章 MDV L-ZY细菌人工染色体重组病毒的获得  34-41
  3.1 材料  34-35
    3.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂  34
    3.1.2 主要仪器  34-35
  3.2 方法  35-38
    3.2.1 电转化转移载体质粒pUAloxPB-gpt-BAC11到宿主菌DH10B  35
    3.2.2 转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11质粒的提取和纯化  35-36
    3.2.3 转染用MDV L-ZY感染细胞总DNA的制备  36
    3.2.4 转移载体质粒与Total-DNA的共转染  36
    3.2.5 重组病毒rv-MDVL-ZY的初步筛选和富集  36-37
    3.2.6 重组病毒rv-MDVL-ZY的纯化  37
    3.2.7 重组病毒rv-MDVL-ZY的鉴定  37-38
  3.3 结果  38-39
    3.3.1 转移载体与病毒感染细胞总DNA的共转染获得重组病毒  38
    3.3.2 重组病毒BAC功能区的PCR鉴定  38-39
  3.4 讨论  39-41
    3.4.1 MDV基因组的完整性对于启动病毒的感染至关重要  39
    3.4.2 用磷酸钙法转染是得到重组病毒的关键  39-40
    3.4.3 用gpt做筛选标记是获得重组病毒的关键  40-41
第四章 BAC分子克隆化病毒的获得及感染性BAC的筛选  41-51
  4.1 材料  41
    4.1.1 菌种、细胞、病毒与试剂  41
    4.1.2 主要仪器  41
  4.2 方法  41-47
    4.2.1 电转化分子克隆化病毒感受态细菌DH10B的制备  41-42
    4.2.2 环化重组病毒细胞总DNA的提取  42
    4.2.3 电转化筛选MDV L-ZYBAC  42-43
    4.2.4 MDV L-ZYBAC的初步鉴定  43
    4.2.5 MDV L-ZY BAC质粒的提取和纯化  43
    4.2.6 MDV L-ZYBAC中BAC-gpt功能序列的PCR鉴定  43
    4.2.7 L-ZYBAC中MDV病毒基因组的PCR鉴定  43-45
    4.2.8 转染用MDV L-ZYBAC DNA的提取和纯化  45
    4.2.9 CEF载体总DNA的制备  45-46
    4.2.10 将L-ZYBAC-DNA转染进CEF  46
    4.2.11 拯救重组病毒BAC-derived MDVL-ZY  46
    4.2.12 拯救重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的鉴定  46
    4.2.13 重组病毒、野生病毒与拯救的重组病毒在体外生长特性的比较  46-47
  4.3 结果  47-49
    4.3.1 MDV L-ZYBAC的初步鉴定结果  47
    4.3.2 MDV L-ZY BAC的病毒基因组的PCR鉴定结果  47-48
    4.3.4 重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的拯救  48-49
    4.3.5 重组病毒rv-MDVL-ZY、野生病毒wt-MDVL-ZY与拯救的重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的病毒生长曲线的比较  49
  4.4 讨论  49-51
    4.4.1 适时提取病毒环化的基因组DNA是获得MDV BAC的关键  49
    4.4.2 电转条件的优化是获得MDVBAC的关键  49-50
    4.4.3 L-ZY BAC DNA的浓度和纯度是重组病毒BAC-derived MDVL-ZY的拯救的关键  50-51
第五章全文结论  51-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
作者简历  59

鸡马立克氏病病毒超强毒L-ZY株细菌人工染色体的构建

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