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TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-Ⅰ和HVT

作　者: 丁维民
导　师: 魏建忠；张训海
学　校: 安徽农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病病毒 UL36和Bcl-2基因 TaqMan-MGB 双重FQ-PCR
分类号: S852.659.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 228次
引　用: 2次
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内容摘要

马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起鸡的一种恶性淋巴肿瘤性疾病,具有高度接触传染性。由于该癌症病的隐蔽性极强,又没有治疗手段,其主要预防措施是1日龄内接种疫苗。但疫苗仅阻止发病而非感染,因此对MDV的感染或污染进行特异性的诊断和监测十分重要。TaqMan-MGB实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术具有快速、灵敏、特异、特别是可以定量测定病毒拷贝数的优点为检测MDV提供了很好的方法。本试验根据GenBank上的Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1) UL36基因和火鸡疱疹病毒(HVT)Bcl-2基因序列,用Primer Express 3.0软件分别设计了MDV-1和MDV-3的特异性引物和TaqMan-MGB探针,根据距阵优势法分别对引物和探针的浓度进行了优化,并在不同退火温度和不同循环数下进行了优化反应,确立了最佳反应体系和反应条件,通过双重实时荧光定量PCR的不交叉反应,最终建立了MDV-1和MDV-3的TaqMan-MGB探针双重实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强,对新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒及鸡胚成纤维细胞提取的DNA均未扩增出荧光定量曲线;将放置不同时间的质粒(1d、30d)分别进行FQ-PCR的检测,发现不同检测时间、不同反应管之间的域值(CT)的变化很小,组内组间变异系数均小于5%,表明本试验建立的方法具有很好的稳定性;将浓度分别为5.45×1010与5.38×1010拷贝数/mL的pBJ-U和pHV-B质粒DNA标准样品分别用去离子水做10的系列倍比稀释,进行常规PCR、FQ-PCR检测,结果表明FQ-PCR的检测灵敏度高出普通PCR 100倍。pBJ-U和pHV-B质粒DNA标准样品分别稀释至10-10时FQ-PCR可灵敏地检测5.45、5.38个拷贝数的病毒,而在pBJ-U和pHV-B质粒DNA稀释到10-8时,常规PCR产物的电泳结果已经不清晰。通过对实验鸡和临床发病鸡的检测,得出本试验建立的双重荧光定量PCR方法可以灵敏地定量检测到MDV-1。在临床发病鸡检测的不同组织样品中,MDV-1含量为103.5~6拷贝数/mL,羽囊中病毒含量最高,达105~6拷贝数/mL;通过对实验免疫攻毒鸡羽囊样品的检测,发现HVT疫苗在一定程度上抑制了MDV-1在体内的复制,使羽囊排毒高峰延迟了两周,与攻毒对照组相比其高峰值下降101~2拷贝数/mL;MDV-3在HVT免疫攻毒组的羽囊中的病毒含量要高于免疫对照组,并且MDV-3在羽囊中的整体复制水平都不高。总之,该方法将为MDV强毒污染监测、临床鉴别诊断、MD发病机理以及疫苗免疫机理的研究提供一种良好的技术手段。

TaqMan-MGB探针双重荧光定量PCR方法绝对定量MDV-Ⅰ和HVT

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