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马立克氏病毒“814”疫苗株全基因组序列测定及分析

作　者: 张锋
导　师: 刘长军
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病病毒疫苗株基因组序列分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

马立克氏病(Marek’s diseas,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)引起鸡的一种肿瘤性疾病。以免疫抑制、神经紊乱和T细胞淋巴瘤为特征。MDV属于疱疹病毒科马立克病毒属成员。根据血清学特性,MDV可分为MDV1、MDV2、HVT 3个血清型,仅MDV1型具有致瘤性。MD的控制以疫苗免疫预防为主,而疫苗的使用以血清1型的最为广泛。尽管通过许多的免疫策略防控MD,仍然有证据表明在最近40年内,MDV朝着更强毒力方向进化。然而,我们更关心的是,在养禽业中,当前的疫苗将不能保护禽类抵抗正在向强毒力进化的田间野毒株的攻击。临床和实验室数据也证明田间野毒株朝着更强毒力的方向进化的现象,但是进化的分子基础仍然是未知的。为了深入了解MDV的致病机制,对涉及到病毒毒力的基因进行更好的了解是必需的。MDV1型“814”疫苗株为自然弱毒株,作为防控MD的疫苗,长期在我国应用,使用效果良好。为了解MDV强、弱毒株全基因组变异情况,本研究根据MDV GA株基因组序列,设计合成覆盖全基因组的66对引物,经PCR扩增,目的片段的克隆,序列拼接以及分析,首次获得了马立克氏病病毒1型中国疫苗株“814”的全基因组序列。MDV 814全长为172,541bp,其基因组中基因结构组成与其他的MDV1型毒株相同。遗传进化树分析表明,MDV 814与疫苗株CVI988的亲缘关系最近。与GenBank登录的强、弱毒株进行比较分析表明:814株基因组长重复区在编码Meq、RLORF6和23KDa的重叠基因内具有177bp的插入。814株在RLORF12基因编码区内存在69bp的缺失,此缺失位于复制起始位点(Origin of Replication ,Ori)内。在编码大的间质蛋白的UL36基因中,与疫苗株CVI988相比,MDV 814株缺失510bp。SNP的鉴定发现,总计24个SNP是疫苗株814、CVI988共有的,不出现在强毒株中,被鉴定SNP发生在基因UL12、UL38、UL39、UL43、LORF8、LORF11、UL46、UL49、UL50、UL52、UL53、RLORF7、RLORF9、RLORF4、US2、US3、SORF4、US6编码的蛋白质中。同时,发现43个814疫苗株特有的氨基酸突变,分布在23个开放阅读框内。本研究是首次对我国的MDV1型“814”疫苗株的全基因组序列进行了系统的测定和分析,并比较了MDV疫苗株和强毒株在基因水平上的差异,为MDV的致病分析、免疫预防和毒株毒力弱化等相关研究提供了依据。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章引言  12-25
  1.1 马立克氏病及马立克氏病毒概述  12-13
  1.2 马立克氏病毒毒力进化  13-14
  1.3 马立克氏病毒在体内的复制和感染  14-15
  1.4 马立克氏病免疫机制  15-16
    1.4.1 体液免疫  15
    1.4.2 细胞免疫  15-16
  1.5 马立克氏病毒基因组  16-23
    1.5.1 马立克氏病毒基因组结构  17-18
    1.5.2 重复区内的基因  18-21
    1.5.3 独特区内的基因  21-23
  1.6 马立克氏病毒蛋白质组学研究  23-24
  1.7 研究的目的和意义  24-25
第二章马立克氏病毒814 疫苗株全基因组序列的测定与分析  25-47
  2.1 材料  25
    2.1.1 毒株和SPF 鸡胚  25
    2.1.2 实验菌体和载体  25
    2.1.3 分子生物学试剂  25
    2.1.4 仪器设备  25
  2.2 试验方法  25-31
    2.2.1 鸡胚成纤维细胞的制备  25-26
    2.2.2 引物设计与合成  26-28
    2.2.3 MDV 基因组提取  28-29
    2.2.4 PCR 反应  29
    2.2.5 目的基因的克隆、鉴定与测序  29-30
    2.2.6 序列的拼接和分析  30-31
  2.3 结果  31-44
    2.3.1 病毒基因组总 DNA  31
    2.3.2 MDV1 型 814 疫苗株独特区的 PCR 扩增和克隆  31-33
    2.3.3 MDV1 型 814 疫苗株重复区的 PCR 扩增和克隆  33
    2.3.4 基因组结构组成  33
    2.3.5 遗传进化树的构建  33-34
    2.3.6 开放阅读框  34-42
    2.3.7 单核苷酸多态性(SNP)  42-44
  2.4 讨论  44-47
第三章全文结论  47-48
参考文献  48-55
附录  55-57
致谢  57-58
作者简介  58

马立克氏病毒“814”疫苗株全基因组序列测定及分析

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