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马立克氏病病毒感染鸡羽髓蛋白质组学研究

作　者: 丛锋
导　师: 刘长军
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 马立克氏病病毒羽髓双向电泳蛋白质组学
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV）分为马立克氏病病毒血清1型（Marek’sdisease virus serotype 1，MDV1）、血清2型（Marek’s disease virus serotype 2，MDV2）和火鸡疱疹病毒（Turkey herpesvirus，HVT）3个血清型，仅MDV1型对鸡有致病性。MDV1属于疱疹病毒科禽疱疹病毒2型，引起以鸡免疫功能障碍、恶性淋巴肿瘤和中枢神经系统损伤为特征的马立克氏病（Marek’s diseas，MD），是鸡的重要传染病。马立克氏病同时也是首个通过疫苗进行控制的肿瘤性疾病，因此受到医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。MDV具有严格的细胞结合性，感染的细胞至少有4种类型，即B细胞、T细胞、巨噬细胞及羽毛囊和肾的上皮细胞。但羽髓上皮细胞(Feather follicl epithelium，FFE)是MDV唯一能够形成游离的有囊膜的病毒粒子的部位。大量有囊膜的感染性病毒粒子伴随羽屑的脱落释放到环境中成为传染源。羽髓（Feather pulp）对于MDV的复制、装配和MD的传播流行具有重要意义，因此感染MDV羽髓组织的相关研究已成为MD的研究热点之一。但目前此类研究大多从DNA或mRNA水平上进行个别基因或蛋白的检测。蛋白质组学技术可以大规模鉴定蛋白质，更真实地反映蛋白质的表达情况。本文建立了适宜羽髓组织蛋白样品的双向电泳方法，对感染MDV强毒鸡羽髓进行蛋白质组学分析，并对感染不同毒力MDV毒株鸡羽髓组织差异蛋白质组学进行研究。1.建立鸡羽髓蛋白双向电泳方法以SPF鸡羽髓组织为研究对象，以固相pH梯度胶条进行等电聚焦为第一向，采用垂直十二烷基磺酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳为第二向进行双向电泳。对上样量、不同pH范围胶条、一向设置参数、凝胶染色方法等进行一系列优化。结果显示羽髓组织在pH 3-10范围13 cm的2-DE胶上可以得到较好的分离效果，采用R350热考染染色效果较好。应用软件对凝胶图谱进行初步分析，可分辨的蛋白点约700个，不同样本间的匹配率大于80%。本研究建立了适宜鸡羽髓蛋白的双向电泳方法，分辨率及可重复性均较高。该方法的建立为羽髓组织蛋白质组学研究提供了可靠的技术基础。2.强毒力MDV感染鸡羽髓差异蛋白质组学研究针对MDV从感染到发病的四个阶段，利用双向电泳技术对感染MDV强毒株后4d、7d、14d和21d羽髓组织蛋白的差异表达情况进行分析。结果显示在MDV感染后四个时期各有显著差异表达蛋白点分别为2个、8个、25个和9个；通过质谱技术鉴定出29种蛋白质，包括能量代谢相关蛋白、增殖和凋亡相关蛋白、细胞骨架蛋白、信号传导蛋白、转录相关蛋白、免疫相关蛋白和其他功能蛋白。鉴定的诸多种差异表达蛋白为进一步揭示羽髓中MDV的复制、基因的表达以及宿主的应答等打下基础。3.强、弱毒株感染鸡羽髓差异蛋白质组学研究针对MDV强、弱毒株的感染可能引起宿主细胞在蛋白水平上的表达情况不同。采用双向电泳技术，将MDV强毒GA株和弱毒疫苗株CVI988感染的羽髓蛋白样品分别进行双向电泳分离；并分析在MDV复制的四个阶段，强、弱毒株感染后引起宿主蛋白差异表达情况。结果显示感染后7d检测到4个显著差异表达蛋白点，其中相对于疫苗株CVI988感染组，GA株感染后上调表达2个，下调表达2个。感染后14d检测到6个显著差异表达蛋白点，相对于同时期疫苗株CVI988感染组，这些蛋白点在GA株感染时全部上调表达。感染后21d检测到5个显著差异表达蛋白点，其中相对于疫苗株CVI988感染，GA株感染后上调表达4个，下调表达1个。利用质谱技术鉴定出7个蛋白点代表5种蛋白质分别是：LASP-1、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like、L-乳酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶和甲硫腺苷磷酸化酶；对于进一步揭示MDV致病机制上的差异及与宿主相互作用关系上的差异等研究具有重要提示作用。本研究通过双向电泳和质谱相结合的技术对感染MDV鸡羽髓蛋白进行差异蛋白质组学研究，获得的结果为进一步揭示MDV与宿主的相互作用关系、感染性病毒粒子的成熟和致病机制提供了研究方向和素材。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章引言  14-26
  1.1 马立克氏病及病原学概述  14-15
  1.2 马立克氏病病毒的复制规律  15-18
  1.3 马立克氏病病毒毒力进化  18-19
  1.4 蛋白质组学概述  19-24
    1.4.1 蛋白质组学的由来  19-20
    1.4.2 蛋白质组学研究内容  20-22
    1.4.3 蛋白质组学主要技术手段的研究进展  22-24
  1.5 马立克氏病的蛋白质组学研究进展  24
  1.6 研究的目的和意义  24-26
第二章马立克氏病病毒感染鸡羽髓蛋白质组学研究  26-42
  2.1 材料及试剂配制  26-28
    2.1.1 毒株和实验动物  26
    2.1.2 主要仪器  26
    2.1.3 分子生物学试剂  26-27
    2.1.4 试剂的配制  27-28
  2.2 建立 MDV 感染动物模型  28-29
    2.2.1 鸡胚成纤维细胞的制备、病毒增殖及效价测定  28
    2.2.2 实验动物分组、接种及病料采集  28
    2.2.3 羽髓组织中总DNA 的提取  28
    2.2.4 PCR 检测体内感染情况  28-29
    2.2.5 琼脂扩散试验检测  29
  2.3 鸡羽髓双向电泳方法的建立  29-30
    2.3.1 鸡羽髓蛋白样品的制备  29
    2.3.2 蛋白浓度测定  29
    2.3.3 一向条件的选择  29-30
    2.3.4 胶条平衡  30
    2.3.5 第二向电泳  30
    2.3.6 R350 染色法与 BlueSilver 染色法的比较  30
  2.4 感染马立克病毒鸡羽髓蛋白质组学分析  30-32
    2.4.1 双向电泳分离MDV 强毒感染鸡和未感染鸡羽髓蛋白  30-31
    2.4.2 双向电泳分离强、弱毒 MDV 感染鸡羽髓蛋白  31
    2.4.3 图像扫描与图谱分析  31
    2.4.4 差异表达蛋白的质谱鉴定  31-32
    2.4.5 差异表达蛋白的生物信息学分析  32
  2.5 结果  32-40
    2.5.1 MDV 感染动物模型  32-33
    2.5.2 鸡羽髓双向电泳方法的建立  33-36
    2.5.3 双向电泳凝胶图谱的分析  36
    2.5.4 MDV 强毒株感染鸡羽髓差异表达蛋白的分析  36-39
    2.5.5 强、弱毒 MDV 感染鸡羽髓差异表达蛋白的分析  39-40
  2.6 讨论  40-42
第三章全文结论  42-43
参考文献  43-48
致谢  48-49
作者简介  49

马立克氏病病毒感染鸡羽髓蛋白质组学研究

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