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CD43表达与造血干细胞发育的相关性研究

作　者: 陈冬波
导　师: 刘兵
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 组织培养 AGM区造血干细胞 CD43
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 43次
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内容摘要

在胚胎的发育过程中,第一个造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)产生于胚内的主动脉-性腺-中肾区(aorta-gonads-mesonephros region,AGM区),稍后出现在胎盘和卵黄囊,而后迁移到胎肝。出生后骨髓代替胎肝成为造血活动的主要场所。这些不同的造血微环境为HSC的产生、成熟、扩增和分化提供合适的调控信号。由于体外的培养条件不足以模拟体内复杂的微环境,HSC在体外容易失去“干性”。组织培养(tissue culture)的方法可保留组织内部三维的、更接近生理状态的微环境,在体外可显著促进HSC的成熟和增殖。在小鼠体节期胚胎,HSC在不同的时间和位点发生。在发育早期(胚胎期10.5-11.5天),HSC数目极少(约1-3个/胚胎),且无特异性的表面标志,这为探讨HSC的发育调控机制增加了难度。因此,为了分离和纯化HSC、明确HSC的具体定位、揭示其发育规律,发现和鉴定新的造血和/或HSC的特异性标记显得尤为重要。本研究的第一部分,我们通过建立特殊的组织培养方法,探讨小鼠胚胎AGM区的造血发育规律。选取小鼠E10.5-E11胚胎的AGM区作为实验对象,建立气液交界的组织培养体系,孵育2天后作如下三类分析:应用集落形成实验在体外观察髓系祖细胞的数量,应用脾结节形成(colony-forming unit of spleen, CFU-S)实验在体内检测髓系祖细胞的变化,利用移植(长期重建)实验考察HSC的发育。结果表明:组织培养后,平均每个E10.5 AGM区的细胞可形成104±18个髓系集落;每个E10.5 AGM区的细胞在致死剂量照射的成年小鼠脾脏中可形成10.8±3.5个CFU-S。更重要的是,经组织培养的E10.5-E11.5 AGM区能高比例(85.7%)、高嵌合(51.12%±21.17%)、长期(>4个月)重建致死剂量照射的成年小鼠的造血系统,在受体的外周血、骨髓、脾脏、胸腺中均能检测到供体来源的淋系或髓系细胞的嵌合。上述数据与经典文献结果相似,证实:体外组织培养确能促进小鼠AGM区HSC的成熟和扩增,是研究胚胎造血发育规律的有效方法。本研究的第二部分,借助于建立的组织培养和移植体系,我们集中研究CD43在不同发育时间和位点的HSC的表达特点。CD43,亦称leukosialin或sialophorin,与CD34、Endomucin等分子都属于内皮唾液黏蛋白质家族成员,具有完整的细胞膜表面黏蛋白。我们的研究立题主要基于如下几点:既往研究表明CD43在人和小鼠的骨髓HSC高表达;人胚胎干细胞和诱导多能干细胞来源的造血祖细胞表达CD43;其表达于人胚胎背主动脉腹侧造血簇(富集造血干祖细胞的特殊细胞群)。此外,CD43与小鼠胚胎发育过程中重要的HSC表面标志CD34在结构上相似,两者标志意义的异同亦是我们感兴趣的问题。为明确CD43在AGM区HSC中的表达,我们将E10.5、E11.5、E12.5 AGM区消化成单细胞悬液,利用免疫磁珠分选,获得CD43+细胞和CD43-细胞,分别按照1-2个胚胎量移植入60Co致死剂量(9 Gy)照射的成年受体小鼠。移植后4个月对外周血进行检测,计算(GFP+CD45+)/CD45+的比值得到嵌合率,≥10%则视为重建。结果发现E10.5、E11.5、E12.5 AGM区CD43+细胞的重建比例分别为2/15、6/12、4/4。相反,所有的CD43-细胞移植受体均未发现重建(n=26)。受体的外周血、骨髓、脾脏、胸腺中含有供体来源的相当比例的髓系、B淋巴细胞、T淋巴细胞,表明AGM区CD43+细胞具有多系分化潜能。同时,通过二次移植实验,证实AGM区CD43+细胞具有自我更新能力。既往研究表明AGM区的HSC存在于c-Kit+CD34+细胞中。进一步的流式分析发现CD43在E11.5AGM的该群细胞中的表达比例为16.2%-22.3%,提示其具有潜在的富集意义。上述数据表明:小鼠胚胎AGM区的HSC均分布在CD43+亚群。既往研究发现:E11.5 AGM区经体外组织培养后,HSC的免疫表型发生变化,从CD34+转变成CD34-,与成体骨髓HSC相同。为明确CD43是否有类似特点,我们将AGM区(E10.5-E11.5)进行2天的组织培养,磁珠分选获得CD43+细胞和CD43-细胞,而后移植入致死剂量照射的受体小鼠。结果发现:E10.5、E11.5 AGM区CD43+细胞的重建比例分别为4/4和6/6,而CD43-细胞均不能重建(n=7)。重建受体的外周血、骨髓、脾脏、胸腺中含有供体来源的相当比例的髓系或淋系细胞,表明经组织培养的AGM区CD43+细胞仍然具有多系分化潜能。上述数据表明:组织培养能促进AGM区CD43+HSC的扩增;与CD34不同,在HSC的体外成熟和增殖过程中,CD43持续表达。近年来,多项研究表明:与AGM区和卵黄囊相似,胎盘也是HSC发育的另一重要位点。为进一步明确CD43在胎盘和卵黄囊来源的HSC中的表达,我们分别将E11.5胎盘和卵黄囊的CD43+细胞和CD43-细胞移植入致死剂量照射的受体小鼠。结果发现胎盘CD43+细胞重建比例为7/7,卵黄囊为5/8,而CD43-细胞均重建失败(n=13)。此外,E11.5胎盘和卵黄囊的CD43+细胞亦具有多系分化潜能。既往研究表明胎盘和卵黄囊中的HSC存在于c-Kit+CD34+细胞中,我们的流式分析发现E11.5胎盘和卵黄囊的该群双阳性细胞中分别有21.2%-33.7%和14.9%-24.0%表达CD43,提示可通过CD43进一步富集上述组织中的HSC。以上数据表明胎盘和卵黄囊中的HSC均表达CD43。胚胎造血时期,AGM区、胎盘、卵黄囊来源的HSC可通过血液循环定居于胎肝,后者成为最重要的HSC扩增位点。为了明确胎肝中的HSC是否表达CD43,我们将E12.5胎肝的CD43+细胞和CD43-细胞移植入致死剂量照射的受体小鼠。结果发现只有胎肝CD43+细胞能重建成体造血(重建比例为5/5),且具有造血多系分化潜能。之前研究表明CD45在E11.5以后开始在HSC上表达。为进一步确定CD43在不同发育阶段胎肝HSC中的表达,我们利用CD43和CD45抗体标记E13.5和E16.5的胎肝细胞,经流式分选获得CD45+CD43high、CD45+CD43mid和CD45+CD43-三群细胞。将其移植后发现仅CD45+CD43high细胞能重建成体造血(E13.5和E16.5的重建比例分别为3/3和6/7),该现象与成体骨髓HSC集中于CD43high亚群相似。与之吻合的是,流式分析发现:富集胎肝HSC的亚群,即Lin-Sca-1+c-Kit+细胞中,CD43的阳性比例>95%。总结:既往认为CD43是一个类似于CD45的造血标志,而本研究将其表达与早期的造血发生紧密的关联起来。作为一个新的胚胎造血发育时期的特异性标记,CD43的独特性表现为:持续表达于HSC发育的各个重要阶段(出现、成熟、扩增)、各个造血组织(AGM区、胎盘、卵黄囊、胎肝)。因此,CD43的标志作用为今后研究基因敲除小鼠的胚胎造血活动提供了一个灵敏的标识,其生理功能亦待进一步深入研究。

全文目录

缩略词  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-16
第一部分：组织培养体系的建立  16-26
  实验流程  16-17
  材料与方法  17-20
  结果  20-25
  小结  25-26
第二部分：CD43 在造血干细胞发育中的表达  26-44
  实验流程  26-27
  材料与方法  27-30
  结果  30-43
  小结  43-44
讨论  44-48
参考文献  48-53
综述  53-60
  参考文献  56-60
附录  60-61
发表文章  61-70
个人简历  70-71
致谢  71

CD43表达与造血干细胞发育的相关性研究

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