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水半夏组织培养、光合特性和miRNA研究

作　者: 丁伟
导　师: 陈集双；廖乾生
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水半夏组织培养光合特性 miRNA鉴定
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水半夏(Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume.)为天南星科独角莲属植物,为我国常见中药材,药用历史悠久,具有较高药用和经济价值。本论文以水半夏为实验材料,进行了一系列的相关性研究,建立一套水半夏的研究平台,主要涉及水半夏组织培养、光合特性以及miRNA检测分析。本研究建立一套水半夏组培快繁体系,并对其操作流程进行规范化和标准化要求,为水半夏优良品种的选育和大规模工厂化生产种苗提供技术和方法。本研究以水半夏块茎为外植体,选择不同浓度植物激素配比的培养基进行筛选试验。结果表明,愈伤培养基:MS + NAA 0.2 mg/L + KT 1.0 mg/L +蔗糖3 % +琼脂6 g/L,可成功诱导水半夏愈伤组织;丛生芽培养基:MS + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L +蔗糖3 % +琼脂6 g/L,诱导不定芽效果较好,增殖倍数高;生根培养基:1/2 MS + NAA 0.2 mg/L + IBA 0.4 mg/L + KT 0.2 mg/L +蔗糖3 % +琼脂6 g/L + AC 0.3 g/L,有利于水半夏不定根的快速形成,12 ~ 14周即可获得再生水半夏植株。同时,对水半夏一次性成苗的研究表明,诱导水半夏分化一次性成苗的最佳激素配比为:NAA 0.2 mg/L + 6-BA 1.5 mg/L +蔗糖3 % +琼脂6 g/L,5 ~ 6周可形成试管苗,10周后可用于炼苗。其次,本课题利用光合分析仪对受黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)侵染的水半夏植株的生长情况、光合气体交换及叶绿素荧光参数变化等进行检测分析,为防治水半夏病毒病提供参考依据。结果显示:CMV对水半夏的植株生长高度、叶片面积、植株重量上均出现抑制作用;感病植株在胞间CO2浓度(Ci)上呈现明显上升,而气孔导率(Gs)和蒸腾速率(E)却显著下降;水半夏叶片中叶绿素含量减少,导致水半夏生长受到抑制。总体而言,CMV侵染水半夏后对其生理状态造成负面影响。与其它已报道的感病植物相似,CMV侵染后水半夏也表现出一系列综合反应。最后,本研究通过real-time PCR和原位合成微流体芯片技术检测水半夏中的microRNA种类,可填补Sanger miRbase数据库中水半夏miRNA记录空白,为进一步研究其miRNA功能提供支持。Realtime-PCR实验设计了10条miRNA引物,结果显示:这10种miRNA在水半夏组织中均存在但表达量有差异。芯片实验中所用的微流体芯片包含34种植物的1450条成熟miRNA探针序列,杂交结果显示:水半夏在该芯片中的检出率为50.62 %,即有734条miRNA在水半夏叶片组织中发生表达。这些miRNA分布于个317个miRNA家族,验证了miRNA分布的广泛性和保守性。设计Real-time PCR初衷是为与芯片实验的结果相互印证,但实际得到的两者实验结果却出现了一定的差异,有待对这两种实验的可靠性、精度进一步分析。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-15
略语表  15-16
第一章文献综述  16-30
  1.1 水半夏概述  16-20
    1.1.1 水半夏的种属与分布  16
    1.1.2 水半夏的植物形态  16-17
    1.1.3 水半夏的生物学特性  17
    1.1.4 水半夏的经济价值  17-18
    1.1.5 水半夏药用生产时所面临的问题  18-19
      1.1.5.1 水半夏的病虫害  18-19
      1.1.5.2 水半夏种植  19
      1.1.5.3 品种退化导致品质及产量下降  19
    1.1.6 水半夏药用生产时所面临的问题  19-20
      1.1.6.1 水半夏组织培养的目的  19
      1.1.6.2 三叶半夏组织培养的借鉴  19-20
  1.2 micoRNA 概述  20-26
    1.2.1 miRNA 的来源、加工及成熟  20-23
    1.2.2 miRNA 的调节功能  23-26
      1.2.2.1 miRNA 的沉默机制  23
      1.2.2.2 miRNA 与植物的生长发育  23-25
      1.2.2.3 miRNA 与植物的应答反应  25-26
    1.2.3 miRNA 研究的发展趋势与问题  26
  1.3 植物光合作用的研究  26-28
    1.3.1 植物光合作用的概述  26-27
    1.3.2 植物光合测定对植物病毒的研究  27-28
  1.4 本研究的目的与意义  28-30
    1.4.1 研究的目的与意义  28
    1.4.2 研究的内容  28-30
第二章水半夏组培快繁体系的建立  30-41
  前言  30
  2.1 材料与实验方法  30-34
    2.1.1 实验材料  30
    2.1.2 试验方法  30-34
      2.1.2.1 培养基配置  30-31
      2.1.2.2 培养条件  31
      2.1.2.3 外植体的处理  31-32
      2.1.2.4 组培苗生长时期的人为划分  32
      2.1.2.5 组织培养的扩繁路线  32-33
      2.1.2.6 愈伤组织的诱导及分化  33
      2.1.2.7 丛生芽增殖培养基的筛选  33
      2.1.2.8 生根培养基的筛选  33-34
      2.1.2.9 一次性成苗培养基的筛选  34
      2.1.2.10 组培苗的炼苗移栽  34
      2.1.2.11 数据统计分析  34
  2.2 结果与分析  34-38
    2.2.1 外植体的灭菌方式  34-35
    2.2.2 愈伤组织的形成与形态分化  35
    2.2.3 丛生芽增殖培养基的优化筛选  35-37
    2.2.4 生根培养基的优化筛选  37
    2.2.5 一次性成苗培养基的筛选  37-38
    2.2.6 组培苗的移栽  38
  2.3 小结与讨论  38-41
第三章 CMV 侵染水半夏的光合特性研究  41-51
  前言  41
  3.1 材料和实验方法  41-43
    3.1.1 实验材料  41-42
    3.1.2 实验仪器  42
    3.1.3 叶片数目、面积、植株高度和重量的测定  42
    3.1.4 总叶绿素、叶绿素a 和叶绿素b 含量的测定  42-43
    3.1.5 光合速率相关参数的测定  43
    3.1.6 统计分析  43
  3.2 实验结果  43-49
    3.2.1 症状发展和植株生长  43-45
    3.2.2 叶绿素含量测定结果  45-47
    3.2.3 光合速率测定结果  47-49
  3.3 小结与讨论  49-51
第四章水半夏部分miRNA 的real-time PCR  51-66
  前言  51
  4.1 材料和实验方法  51-61
    4.1.1 实验材料  51
    4.1.2 酶、试剂以及实验仪器  51-52
    4.1.3 荧光定量PCR 引物的设计  52-56
    4.1.4 水半夏185 rRNA 引物验证和鉴定  56-58
      4.1.4.1 CTAB 法提取水半夏基因组DNA  56-57
      4.1.4.2 PCR 扩增  57-58
    4.1.5 Real-time PCR 实验的total RNA 提取  58-59
    4.1.6 DNA 消化  59
    4.1.7 荧光定量real-time PCR  59-61
  4.2 结果与分析  61-64
    4.2.1 水半夏185 rRNA 的验证结果  61
    4.2.2 Real-time PCR 的total RNA 提取结果  61-62
    4.2.3 Real-time PCR 的测定结果  62-64
  4.3 小结与讨论  64-66
第五章水半夏miRNA 的芯片鉴定  66-89
  前言  66
  5.1 材料与方法  66-70
    5.1.1 材料与探针设计  66-68
    5.1.2 芯片的质量控制  68-69
    5.1.3 荧光标记样品的制备和芯片杂交  69-70
    5.1.4 数据获得与分析  70
  5.2 结果与分析  70-86
    5.2.1 芯片设计结果  70-72
    5.2.2 水半夏total RNA 提取结果  72-73
    5.2.3 芯片杂交结果  73-74
    5.2.4 植物保守性miRNA 在水半夏中的表达  74-85
    5.2.5 水半夏miRNA 保守性分析  85-86
  5.3 小结与讨论  86-89
总结与展望  89-91
参考文献  91-96
附录：重要溶液的配制  96-98
致谢  98-99
攻读学位期间的研究成果  99

水半夏组织培养、光合特性和miRNA研究

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