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造血发育相关因子对小鼠AGM区血液血管干细胞的调节作用

作　者: 张悦
导　师: 孙新
学　校: 广州医学院
专　业: 儿科学
关键词: 血液血管干细胞 BL-CFC AGM区造血发育
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

血液血管干细胞(hemangioblast)是一种具有双向分化潜能的干细胞,在体内外发育的过程中,能够分化成为造血细胞和内皮细胞。血液血管干细理论已经通过在胚胎干细胞分化模型中得到验证,即胚胎干细胞经2.5-3.5天分化为拟胚体,再在特殊的分化体系中可以形成一种特殊的Blast样集落,其具有同时分化产生内皮细胞和造血细胞的能力,这种形成Blast样集落的细胞被称为BL-CFC(the blast colony-forming cell)。近年来,血液血管干细胞在起源、分子生物学特点、体外诱导分化等方面的研究取得了较大进展。既往研究发现小鼠胚胎定向造血的起源部位AGM区亦存在类似血液血管干细胞的前体HPP-HA。之后在小鼠胚胎AGM区同样发现了BL-CFC的存在,建立了特殊的的血液血管干细胞模型,此模型已被应用于研究小鼠AGM区血液血管干细胞的发育和调控,如经典的造血生长因子IL-3也可以促进血液血管干细胞的发育和分化。然而,鉴于血清培养体系营养成分复杂,不利于精细研究某些细胞因子对血液血管干细胞的真实作用。因此,本研究在小鼠胚胎AGM区已建立的BL-CFC模型的基础上,建立了一个BL-CFC的无血清孵育培养模型,优化了常规的BL-CFC培养体系,并在此基础上,研究造血发育相关因子对小鼠AGM区血液血管干细胞的调节作用。本研究首先在小鼠胚胎AGM区建立了BL-CFC的无血清孵育培养模型。取E10.5小鼠胚胎AGM区,消化成单细胞,在无血清培养体系下孵育12h后进行半固体集落培养。在bFGF、SCF、VEGF、IL-6、IGF-I和LIF细胞生长因子的共同作用下培养3-3.5天后,可见一种特殊形态的集落开始出现,其形态和分化特征与E9.5-12.5小鼠胚胎AGM区来源的Blast集落相似。然后进行BL-CFC造血及内皮分化功能鉴定。集落培养4-5天后,挑取单个集落进行造血集落培养。所有的BL-CFC可产生CFU-E、CFU-GM、CFU-Mix等一种或多种造血集落。贴壁细胞换EGM2内皮细胞完全培养基继续进行诱导,第7-10天时可见贴壁细胞中有大量鹅卵石样内皮细胞以及少量成熟的造血细胞。随后进行体外成血管功能检测,结果表明:贴壁细胞高比例的吞噬LDL;体外Matrigel上可形成血管样结构,呈网络状生长。同时,将BL-CFC在OP9基质细胞上进行造血和内皮细胞分化功能检测。挑取单个Blast集落,接种于OP9基质细胞上培养7-10天后,所有集落在OP9上均显示造血细胞的分化潜能(CD45阳性),30%的HA在OP9上可以形成CD31阳性的管样结构。接下来,研究了三种与造血发育相关的细胞因子IL-3、SCF和NGF对小鼠胚胎AGM区细胞的调节作用。将上述3种细胞因子与AGM区细胞分别在SR及FBS体系下体外共孵育12小时后进行BL-CFC接种,结果显示IL-3在两种体系下均能扩增BL-CFC,而NGF在两种体系下对BL-CFC均无作用,SCF只在SR体系中对BL-CFC有明显的扩增作用。综上,本研究在小鼠胚胎AGM区建立了BL-CFC的无血清孵育培养模型,优化了常规的BL-CFC培养体系,基于上述模型,深入探讨了造血发育相关因子IL-3、SCF和NGF在血清及无血清两种孵育培养模式下对小鼠胚胎AGM区细胞的调节作用,与血清体系相比,无血清体系更能灵敏、准确的反映细胞因子对血液血管干细胞的作用,从而体现了无血清培养模型的优势。

全文目录

英文缩略语表  3-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-12
第一部分小鼠 AGM 区血液血管干细胞的研究体系优化  12-27
  材料和方法  15-21
  结果  21-26
  小结  26-27
第二部分造血发育相关因子对小鼠 AGM 区血液血管干细胞的调节作用  27-33
  材料和方法  27-30
  结果  30-32
  小结  32-33
讨论  33-37
全文结论  37-38
参考文献  38-41
综述  41-54
  参考文献  45-54
致谢  54-55

造血发育相关因子对小鼠AGM区血液血管干细胞的调节作用

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