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类胡萝卜素的制备、分离及其相关生物合成的初步研究

作　者: 王慧敏
导　师: 游松
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 类胡萝卜素叶黄素类球红细菌生物合成胡萝卜素β-环羟化酶
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

类胡萝卜素是广泛存在于自然界生物体内的一大类萜类色素，它能够预防癌症和慢性病，并有很强的肿瘤抑制活性，其药用潜力引起了人们极大的关注。化学法提取、合成天然类胡萝卜素比较困难，而微生物产生的类胡萝卜素种类很少，限制了类胡萝卜素的应用。目前已经实现了利用大肠杆菌异源合成类胡萝卜素，但是存在着前体供应不足的代谢“瓶颈”以及菌体类胡萝卜素承载能力有限等问题。本课题欲以自身产生链状类胡萝卜素的光合细菌作为基因工程菌，利用载体导入高等植物类胡萝卜素关键环化酶基因，使其在菌体中表达并催化链状类胡萝卜素，异源合成环化类胡萝卜素。本文通过皂化、冷冻结晶等化学手段，从叶黄素树脂(由万寿菊制得)中分离得到纯度较高的叶黄素粗品，其含量达到50％～60％，收率达到70％～80％。利用硅胶柱层析进一步纯化，得到含量大于98％的叶黄素纯品。选择类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，对其菌体代谢产物进行提取分离，得到其中一种主要的类胡萝卜素，并利用电转化法实现了模式质粒对Rhodobactersphaeroides的转化。利用试剂盒从万寿菊花瓣中提取植物总RNA，反转录得到cDNA，用已知植物中BCH(胡萝卜素β—环羟化酶)和LYCB(番茄红素β—环化酶)的保守氨基酸序列来设计简并引物，利用PCR方法克隆叶黄素关键合成酶基因的部分片段。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-12
缩略语说明  12-13
第一章前言  13-22
  1.1 类胡萝卜素的生物学功能及生理作用  13-14
  1.2 天然类胡萝卜素的生物合成  14
  1.3 国内外类胡萝卜素的开发及应用现状  14-19
  1.4 类胡萝卜素基因工程的研究  19-20
  1.5 本实验研究方向  20-22
第二章相关类胡萝卜素的制备和结构鉴定  22-34
  2.1 实验材料  22-24
  2.2 万寿菊中叶黄素的制备  24-31
    2.2.1 叶黄素粗品的制备  24-27
    2.2.2 叶黄素纯品的制备  27-29
    2.2.3 纯品的结构鉴定  29-31
  2.3 Rhodobacter sphaeroides中主要类胡萝卜素成分的提取分离  31-33
    2.3.1 Rhodobacter sphaeroides中类胡萝卜素的提取  31-32
    2.3.2 薄层制备Rhodobacter sphaeroides中主要类胡萝卜素成分  32-33
  2.4 实验结果与讨论  33-34
第三章模式质粒对Rhodobacter sphaeroides的转化  34-38
  3.1 实验材料  34-35
  3.2 实验方法  35-36
    3.2.1 Rhodobacter sphaeroides对常用抗生素的天然抗性水平  35
    3.2.2 CaCl_2法  35-36
    3.2.3 一步转化法  36
    3.2.4 电转化法  36
  3.3 实验结果与讨论  36-38
第四章类胡萝卜素相关生物合成的初步研究  38-53
  4.1 实验材料  38-39
  4.2 实验方法  39-47
    4.2.1 CTAB法提取植物总RNA  39-40
    4.2.2 试剂盒提取植物总RNA  40
    4.2.3 BCH cDNA和LYCB cDNA部分序列的克隆  40-42
    4.2.4 DNA片段的纯化  42-44
    4.2.5 重组质粒的构建及鉴定  44-47
  4.3 实验结果与讨论  47-53
第五章结论  53-54
附图  54-57
参考文献  57-60
致谢  60

类胡萝卜素的制备、分离及其相关生物合成的初步研究

内容摘要

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