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产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能分析

作　者: 蒋淑贞
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 产酶溶杆菌OH11 胞外酶调控 基因克隆 功能分析
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


菌株OH11是从本试验室从辣椒根际土壤中分离得到的一种新型生防细菌,是国内首次报道的一株产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes),属于黄单胞科(Xanthomonadaceae),溶杆菌属(Lysobacter)。该菌富含G+C,有滑行现象,能产生多种胞外酶,包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶等,对许多植物病原真菌、卵菌及线虫等都有很好的拮抗活性,具有广阔的应用前景。虽然国内外的研究已证实胞外酶是该菌重要的拮抗因子,但对于不同胞外酶的产生是否依赖于调控基因的操纵?这些调控基因有何生防功能等问题仍没有得到很好的解答。鉴于此,本研究以OH11菌株为研究对象,克隆该菌株中调控4种胞外酶产生的相关基因,并对克隆的基因进行功能分析,以明确这些基因在该菌株拮抗活性和生物防治中的作用。利用mariner转座子对产酶溶杆菌OH11进行转座诱变,构建产酶溶杆菌OH11的突变体文库。通过突变株在四种不同的胞外酶(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶、p-1,3-葡聚糖酶)检测培养基上降解圈的大小来判断突变株是否缺失或降低了相应胞外酶的产生这一方法,从5000多株突变株中筛选到一株对四种胞外酶的产生均有大幅减少的突变株D-11。通过亚克隆的方法,鉴定了mariner转座子在细菌染色体上的插入位点为一个编码羧基末端蛋白酶(carboxy-terminal protease)基因ctp。序列分析表明：该基因全长2214bp,G+C%为69%,在蛋白质水平上与Stenotrophomonas maltophilia菌株的Ctp序列同源性达79%,与Xanthomonas campetris菌株的Ctp序列同源性达78%。利用自杀载体pEX18GM,通过同源重组的方法,构建了ctp基因定向缺失突变体Δctp,通过基因互补,构建了Δcp的互补菌株△ctp (pBBR-PBCTP).对突变体的特性研究后发现,(1)突变体△cp与野生型OH11在营养丰富型(2YT)与营养缺陷型(MMX)培养基中生长速率基本一致；(2)突变体△ctp降低了蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生量,但是对几丁质酶的产生并没有影响；(3)突变体△ctp明显减少了OH11生物膜的产生量；(4)突变体△ctp改变了其在羧甲基纤维素固体培养基与昆布多糖固体培养基上的菌落形态,野生型呈现光滑饱满的黄色菌落,相比之下突变体则明显的干燥偏小,且菌落周围粗糙不光滑。研究还表明,突变体虽然在一定程度上降低了OH11胞外水解酶的产生量,但是基本不改变其对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌和辣椒疫霉病菌的平板拮抗活性。本研究为深入阐析产酶溶杆菌胞外酶调控机制提供了试验数据和理论基础。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10上篇 文献综述  10-30  第一章 植物病害生物防治研究进展  12-22    1 植物病害生物防治研究概况  12-14    2 生防细菌在植物病害防治中的应用  14-16    3 酶在植物病害生物防治中的作用  16-22  第二章 生防细菌产酶溶杆菌的研究进展  22-30    1 分类地位  22-23    2 形态学及生物学特征  23    3 产酶溶杆菌(L.enzymogenes)在植物病害生物防治中的应用  23-24    4 产酶溶杆菌(L.enzymogenes)的生防机理  24-30      4.1 胞外酶  24-26      4.2 胞外酶调控机制  26-27      4.3 次生代谢  27-29      4.4 生物表面活性剂  29      4.5 诱导抗性  29-30下篇 研究内容  30-80  第一章 产酶溶杆菌OH11突变体文库的构建及四种胞外酶缺失突变株的筛选  32-52    1. 试验材料  34-37      1.1 供试菌株、质粒  34      1.2 引物  34-35      1.3 培养基、抗生素配制  35-37    2. 试验方法  37-45      2.1 细菌基因组DNA的提取  37-38      2.2 质粒提取  38-39      2.3 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  39-40      2.4 PCR产物回收"TA"克隆  40      2.5 大肠杆菌感受态的制备和转化  40-42      2.6 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建及验证  42-43      2.7 四种胞外酶缺失的L.enzymogenes OH11突变株的筛选及16S rDNA测序分析  43-44      2.8 L.enzymogenes OH11四种胞外酶缺失突变株中转座子插入位点鉴定  44-45    3 结果分析  45-50      3.1 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建及验证  45-46      3.2 四种胞外酶产量减少的L.enzymogenes OH11突变株的筛选及鉴定  46-48      3.3 克隆鉴定突变株D-11中mariner转座子的插入位点  48-50    4 讨论  50-52  第二章 ctp基因的敲除及突变体特性的初步研究  52-80    1 试验材料  53-56      1.1 试验菌株、质粒和培养条件  53-55      1.2 引物  55      1.3 培养基配制  55-56    2 试验方法  56-64      2.1 L.enzymogenes OH11中ctp基因的定向敲除及验证  56-59      2.2 ctp互补菌株的构建及验证  59-61      2.3 胞外酶测定  61-62      2.4 生长曲线测定  62      2.5 生物膜测定  62-63      2.6 菌落形态观察  63      2.7 胞外多糖(EPS)的检测  63      2.8 病原真菌和卵菌的平板拮抗活性测定  63-64    3 结果分析  64-76      3.1 L.enzymogenes OH11的ctp突变体的构建及验证  64-67      3.2 ctp互补菌株的构建及验证  67-70      3.3 ctp基因的突变影响OH11三种胞外酶的产生  70-72      3.4 ctp基因的突变不影响OH11的正常生长  72-73      3.5 ctp基因的突变降低了OH11生物膜的形成  73-74      3.6 ctp基因的突变改变了OH11的菌落形态  74      3.7 ctp基因的突变不影响胞外多糖产生  74-75      3.8 ctp基因的突变不改变OH11对病原真菌河卵菌的拮抗活性  75-76    4 讨论  76-80参考文献  80-90致谢  90

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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