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依博素ste11基因的功能性质及乳酸菌糖基转移酶基因对ste7和ste22的置换研究

作　者: 鲍勇刚
导　师: 李元
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 苏氨酸 脱氢酶 乳酸菌 生物合成 双交换 博士学位论文 葡萄糖 链霉菌 硫链丝菌素 拮抗活性
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


链霉菌139产生一种新型微生物胞外多糖依博素,具有明显抗类风湿性关节炎的作用,已申报临床研究,有望发展成为新药。我们已确定依博素生物合成基因簇,其包含27个开放阅读框(stel-ste27)。以往已对ste6,ste7,ste10,ste15,ste17,ste19和ste22基因在依博素生物合成中的作用进行了研究。Ste11基因大小为2100bp。经同源性分析,ste11基因编码的蛋白与不同微生物来源的苏氨酸脱氢酶(TDH)具有较高同源性。为确定ste11编码蛋白的性质,将该基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a,转化至E.coli BL21,SDS-PAGE分析表明,在预计的分子量大小处出现了一条新的蛋白条带。重组蛋白采用组氨酸亲合层析柱进行纯化。纯化的重组蛋白酶促反应表明在NAD~+存在的条件下该酶可催化苏氨酸生成2-氨基-3酮基丁酸(AKB)和NADH,表明其为苏氨酸脱氢酶,Km值为0.2mM,最适温度为37℃,最适pH为7.5。为了解ste11在依博素生物合成中的功能,通过同源重组双交换对ste11进行了基因阻断研究,获得基因阻断变株Streptomyces sp.139(ste11~-),Southern杂交证明ste11基因已被成功阻断。对突变株进行了基因回复实验,得到基因互补株。单糖分析表明Streptomyces sp.139(ste11~-)产生的胞外多糖EPS-m单糖比例与依博素相似。基因互补株Streptomyces sp.139(pKC11C)产生的胞外多糖EPS-c单糖比例与EPS-m相似。IL-1R的拮抗活性显示,EPS-m的拮抗活性较依博素明显降低,但EPS-c的拮抗活性有所恢复。此外EPS-m的分子量明显低于依博素,上述结果表明ste11对依博素的生物活性及单糖重复单元的聚合度有显著影响,据此推测苏氨酸可能存在于依博素分子侧链,ste11在依博素的生物合成中可能起修饰基因作用。糖基转移酶在微生物胞外多糖的生物合成过程中起重要作用,在多糖生物合成基因簇中引入异源糖基转移酶基因可改变多糖结构获得新衍生物,并可验证被置换基因功能及多糖构效关系。本研究从产生胞外多糖的乳酸菌基因组DNA,PCR扩增获得其多糖生物合成簇的葡萄糖糖基转移酶基因。分别以缺失sre22(编码鼠李糖糖基转移酶)、ste7(编码岩藻糖糖基转移酶)的依博素产生菌突变株为受体菌,通过同源重组双交换将该糖基转移酶基因置换至依博素生物合成基因簇中。Southern杂交验证获得了基因置换菌株Streptomyces sp.139(ste7HC)和Streptomyces sp.139(ste22HC),分离纯化了两菌株产生的胞外多糖EPS-HC22、EPS-HC7,结果表明其单糖组分与依博素相比,葡萄糖均有显著提高;但对白介素Ⅰ受体拮抗活性显著降低;分子量低于依博素。这说明鼠李糖和岩藻糖在依博素生物活性中有重要作用,此外乳酸菌葡萄糖糖基转移酶基因与依博素的葡萄糖糖基转移酶基因同源率仅25%,因此异源表达的葡萄糖可能在糖键类型上与依博素不同,从而影响生物活性及单糖重复单元聚合度,相关研究尚需进一步深入研究。综上所述,本研究通过对ste11基因的表达、敲除及异源置换ste22、ste 7基因等策略,有效的确定了上述基因在依博素生物合成中的作用,并获得相应的新的依博素衍生物。为通过组合生物学途径研究多糖结构与生物活性关系奠定了较好的基础。苏氨酸脱氢酶在链霉菌中的研究尚属首次报道。

全文目录


缩略语一览表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-12
材料与方法  12-33
  一、实验材料  12-17
  二.实验方法  17-33
结果与讨论  33-84
  第一部分:依博素生物合成基因ste11的克隆、表达、性质及其在依博素合成中的功能研究  33-65
  第二部分:乳酸菌来源葡萄糖糖基转移酶基因置换ste7和ste22的研究  65-84
结论  84-87
  本工作主要取得了以下结果  84-85
  本研究的创新性  85-86
  展望  86-87
参考文献  87-93
综述:微生物来源苏氨酸脱氢酶(TDH)的研究进展  93-110
待发表文章  110-111
致谢  111-112

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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