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产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能研究

作　者: 曹剑磊
导　师: 石贵阳
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 琥珀酸重组大肠杆菌代谢调控基因敲除 Xer/dif重组酶系统
分类号: TQ921.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

琥珀酸是一种重要的化工产品,广泛应用于食品、农业、医药及精细化工等领域,市场前景巨大。相比于传统的化学生产法,微生物发酵法生产琥珀酸具有无可比拟的优点和潜力,引起了国内外众多研究机构的高度关注。其中运用基因工程手段构建高产琥珀酸的重组大肠杆菌是近年来的研究热点,由于野生大肠杆菌厌氧发酵产物中琥珀酸含量低,且有大量副产物。要达到高产琥珀酸的目的,就必须为其进行代谢途径的改造,阻断代谢支路,引导碳流更快更多的流向目标产物。本文利用Xer/dif重组酶系统,对一株野生大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013开展了代谢途径的调控研究。首先为了消除发酵过程中产生的杂酸等副产物,本文敲除了E. coli CICIM B0013琥珀酸代谢竞争途径中包括乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因(ackA-pta)、乳酸脱氢酶基因(ldhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB),乙醇脱氢酶基因(adhE)在内的关键酶基因,所得到的重组菌株E. coli B0013-1040具备厌氧条件下高效转化葡萄糖生成琥珀酸的能力,发酵液中无乙酸,甲酸等副产物生成。其次本文在琥珀酸代谢支路已被阻断的大肠杆菌菌株基础上又进行了葡萄糖吸收方式的调整研究。为关闭其葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS),敲除了该系统中关键酶ⅡCBGlc的编码基因ptsG,促使半乳糖协同运输系统成为大肠杆菌葡萄糖运输的主要途径。这项改变大大增加了琥珀酸的合成前体PEP,得到的重组菌株E. coli B0013-1050经发酵实验结果显示产琥珀酸能力得到了大幅度提升。厌氧转化36 h琥珀酸产量达到30.5 g/L,生产强度为0.85 g/L·h,葡萄糖-琥珀酸糖酸转化率为65.2 %,发酵液经HPLC未检测到乙酸等杂酸。另外,ptsG基因的缺失也解除了葡萄糖代谢产物对菌体的抑制,使大肠杆菌可以同时利用葡萄糖以外的多种碳源,很大程度上拓宽了琥珀酸发酵的底物谱,为降低生产成本,大规模工业化生产打下了基础。为加强琥珀酸合成途径,引导代谢流更多的流向草酰乙酸这一关键节点,本文强化表达了PEP羧化酶。通过将大肠杆菌内源ppc基因与不同拷贝数质粒的连接,导入重组菌,从而使实现对ppc基因在宿主体内表达剂量的控制。研究发现在琥珀酸生产过程中,PEP羧化酶的表达剂量并非越高越好,而是需要控制在一个合理的水平才能有效促进琥珀酸的积累。实验中得到的重组菌E. coli B0013-1050(pTH-ppc)是所有重组菌中生产能力最强的一株,厌氧转化葡萄糖36 h琥珀酸产量达到36.2 g/L,生产强度为1.01 g/(L·h),葡萄糖-琥珀酸转化率为64.3%,在已公开的同类文献中处于先进水平。最后本文还对构建大肠杆菌厌氧发酵产琥珀酸的乙醛酸循环的可行性进行了探讨和研究。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章前言  8-17
  1.1 琥珀酸的理化性质  8
  1.2 琥珀酸的功能用途与市场分析  8-9
  1.3 琥珀酸的生产方法  9-10
    1.3.1 化学合成法  9-10
    1.3.2 生物转化法  10
    1.3.3 微生物发酵法  10
  1.4 发酵法产琥珀酸的研究现状及国内外最新进展  10-15
    1.4.1 产琥珀酸厌氧螺菌的研究进展  11-12
    1.4.2 产琥珀酸放线杆菌的研究进展  12
    1.4.3 大肠杆菌产琥珀酸的研究进展  12-15
  1.5 代谢工程与基因敲除技术  15-16
  1.6 本论文的研究意义与研究内容  16-17
第二章材料与方法  17-21
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 菌株与质粒  17
    2.1.2 工具酶和试剂  17
    2.1.3 引物  17-18
    2.1.4 染色体与质粒提取试剂  18
    2.1.5 培养基和培养条件  18
    2.1.6 主要仪器和设备  18-19
  2.2 方法  19-21
    2.2.1 大肠杆菌质粒DNA 的提取  19
    2.2.2 大肠杆菌JM109 感受态细胞的制备及转化  19-20
    2.2.3 目标基因的删除  20
    2.2.4 重组大肠杆菌在发酵罐中发酵实验  20
    2.2.5 发酵产物检测  20
    2.2.6 其他细胞培养及分子操作  20-21
第三章结果与讨论  21-41
  3.1 E. coli CICIM B0013 琥珀酸合成途径竞争途径的阻断  21-26
    3.1.1 乳酸脱氢酶基因(ldhA)的敲除  21-22
    3.1.2 丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的敲除  22-23
    3.1.3 乙醇脱氢酶基因(adhE)的敲除  23-24
    3.1.4 重组菌E. coli B0013-1040 的生理特性研究  24-25
    3.1.5 重组菌E. coli B0013-1040 的发酵特性研究  25-26
  3.2 大肠杆菌磷酸转移酶系统(PTS)的改造  26-32
    3.2.1 ptsG 基因的敲除  27-30
    3.2.2 重组菌E. coli B0013-1050 的生理特性研究  30-31
    3.2.3 重组菌E. coli B0013-1050 的发酵特性研究  31-32
  3.3 琥珀酸合成途径的强化  32-36
    3.3.1 重组质粒pUC19-ppc 的构建  32-33
    3.3.2 重组质粒pBR322-ppc 的构建  33-34
    3.3.3 重组质粒pTH-ppc 的构建  34-35
    3.3.4 带有不同拷贝数质粒重组菌株的生理特性和发酵性能研究  35-36
  3.4 构建大肠杆菌厌氧发酵产琥珀酸的乙醛酸循环  36-41
    3.4.1 iclR 基因的敲除  37-39
    3.4.2 重组菌E. coli B0013-1060(pTH-ppc)的发酵特性研究  39-41
论文结论与展望  41-43
致谢  43-44
参考文献  44-48
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  48

产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能研究

内容摘要

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