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核黄素生物合成抑制剂产生菌的筛选及研究

作　者: 姚青青
导　师: 裘娟萍；黄海婵
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 核黄素生物合成抑制剂活体筛选假丝酵母菌种鉴定
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

核黄素(riboflavin)是辅因子FAD和FMN的前体物,人和动物除肠道细菌能少量合成外需从食物中获取,而许多微生物如革兰氏阴性致病细菌、病原酵母由于缺乏有效摄取体系,依赖自身内源合成。因此核黄素的生物合成可作为抑菌物质筛选新靶标。本研究旨在从土壤中活体筛选出能抑制核黄素生物合成的菌株,体外验证其抑制性能并进行菌种鉴定,确定活性物质合成的最优培养基和最优发酵条件,研究结果如下:(1)采用活体筛选模型,以核黄素产生菌假丝酵母(Candida famata)为指示菌,琼脂移块法初筛,管碟法和摇瓶发酵法复筛,获得一株能抑制假丝酵母核黄素合成的菌株Q210,对单位菌体量酵母的核黄素合成抑制率达57.63%。(2)构建假丝酵母核黄素体外酶合成反应体系,对菌株Q210抑制核黄素合成进行体外验证,结果显示菌株Q210活性产物对核黄素合成抑制率达93.62%。对该体系反应条件进行优化:酵母粗酶液最适反应温度为29℃,最适反应时间为30 min,置-30℃冰箱可储存45 d,酶活力保持在91.75%以上。(3)对菌株Q210进行形态、生理生化研究,结合16S rDNA序列分析,确定该菌为Bacillus subtilis。(4)对菌株Q210活性产物的理化性质进行研究。研究表明,该活性物质为胞内水溶性产物,在20℃~90℃及pH 2~12范围内能较稳定存在,置4℃冰箱可保存10天活性基本不变。蛋白酶K试验显示活性物质为多肽类或蛋白类物质。(5)对菌株Q210的基础发酵培养基和发酵条件进行研究。结果发现:菌株Q210最佳基础发酵培养基为改良碱性PDA培养基,最佳发酵时间为4 d,发酵条件正交试验优化结果为菌龄为60 h、装液量为40 mL、发酵初始pH为8.0和接种量为2%。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-16
第一章文献综述  16-33
  1.1 核黄素生物合成途径及关键酶  16-18
  1.2 关键酶的催化机制  18-19
    1.2.1 LS 的催化机制  18
    1.2.2 RS 的催化机制  18-19
  1.3 关键酶的晶体结构  19-20
    1.3.1 LS 的晶体结构  19-20
    1.3.2 RS 的晶体结构  20
  1.4 核黄素生物合成关键酶抑制剂的筛选模式  20-22
    1.4.1 底物参与反应的高通量筛选法  20-21
    1.4.2 以酶亲和力特性为基础的无底物参与的高通量筛选法  21-22
    1.4.3 高通量筛选法的优缺点  22
  1.5 近十年国内外核黄素生物合成关键酶抑制剂的研究进展  22-27
    1.5.1 ARAP 结构类似物  22-24
    1.5.2 LS 反应中间体类似物  24-25
    1.5.3 lumazine 类似物  25-26
    1.5.4 无结构相似性化合物  26-27
  1.6 论文选题意义及主要内容  27-29
  参考文献  29-33
第二章核黄素生物合成抑制剂产生菌的活体筛选  33-48
  2.1 前言  33-34
  2.2 材料与方法  34-40
    2.2.1 土样来源  34-35
    2.2.2 菌株  35
    2.2.3 主要仪器设备  35-36
    2.2.4 主要药品与试剂  36
    2.2.5 培养基  36-37
    2.2.6 假丝酵母的斜面培养  37
    2.2.7 假丝酵母的种子培养  37-38
    2.2.8 假丝酵母的发酵培养  38
    2.2.9 假丝酵母菌体的收集与洗涤  38
    2.2.10 核黄素标准溶液的配制  38
    2.2.11 土壤稀释液的制备  38
    2.2.12 土壤微生物的分离  38
    2.2.13 核黄素生物合成抑制剂产生菌的初筛方法  38-39
      2.2.13.1 24 孔板琼脂移块法  38-39
      2.2.13.2 平板琼脂移块法  39
    2.2.14 核黄素生物合成抑制剂产生菌的复筛方法  39-40
      2.2.14.1 发酵液预处理  39
      2.2.14.2 管碟法  39
      2.2.14.3 摇瓶发酵法  39-40
    2.2.15 发酵液菌体浓度和核黄素含量测定方法  40
    2.2.16 核黄素含量荧光测定法  40
  2.3 结果与讨论  40-46
    2.3.1 假丝酵母利用外源核黄素能力的研究  40-42
    2.3.2 核黄素生物合成抑制剂产生菌的初筛  42-43
    2.3.3 核黄素生物合成抑制剂产生菌的复筛  43-46
      2.3.3.1 管碟法复筛  43-44
      2.3.3.2 摇瓶发酵复筛核黄素合成抑制剂产生菌  44-46
  2.4 本章小结  46
  参考文献  46-48
第三章核黄素体外酶合成反应体系的构建  48-60
  3.1 前言  48
  3.2 材料与方法  48-51
    3.2.1 菌株  48-49
    3.2.2 主要仪器  49
    3.2.3 主要药品与试剂  49
    3.2.4 假丝酵母培养基  49-50
    3.2.5 假丝酵母的培养  50
    3.2.6 假丝酵母粗酶液的提取  50
      3.2.6.1 菌体的收集和洗涤  50
      3.2.6.2 菌体的破碎  50
    3.2.7 荧光法检测核黄素浓度标准曲线绘制  50-51
  3.3 结果与讨论  51-58
    3.3.1 荧光法检测核黄素浓度标准曲线绘制  51
    3.3.2 核黄素体外酶合成反应体系的构建  51-54
      3.3.2.1 反应体系中底物浓度的确定  51-52
      3.3.2.2 假丝酵母粗酶液的提取  52
      3.3.2.3 反应体系的构建  52-54
    3.3.3 体外酶反应条件的研究  54-56
      3.3.3.1 反应时间对体外酶合成核黄素的影响  54
      3.3.3.2 反应温度对体外酶合成核黄素的影响  54-55
      3.3.3.3 粗酶液储存时间对体外酶合成核黄素的影响  55-56
    3.3.4 菌株Q210 活性产物对酵母粗酶液体外合成核黄素的影响  56-58
      3.3.4.1 活性物质对核黄素的影响  56-57
      3.3.4.2 活性物质对酵母粗酶液体外合成核黄素的影响  57-58
  3.4 本章小结  58-59
  参考文献  59-60
第四章菌株Q210 的分类鉴定  60-75
  4.1 前言  60
  4.2 材料与方法  60-68
    4.2.1 菌株  60-61
    4.2.2 主要仪器设备  61
    4.2.3 主要药品与试剂  61-62
    4.2.4 培养基  62-64
    4.2.5 菌株Q210 的斜面培养  64
    4.2.6 菌株Q210 的种子培养  64
    4.2.7 16S rDNA 鉴定  64-66
    4.2.8 传统鉴定  66-68
      4.2.8.1 形态观察  66-67
      4.2.8.2 生理生化鉴定  67-68
  4.3 结果与讨论  68-73
    4.3.1 菌株Q210 16S rDNA 测序结果  68-69
    4.3.2 16S rDNA 序列对比及系统进化树的构建  69-70
    4.3.3 菌株Q210 的传统鉴定  70-73
      4.3.3.1 形态观察  70-73
      4.3.3.2 生理生化性状  73
  4.4 本章小结  73-74
  参考文献  74-75
第五章菌株Q210 活性产物理化性质的研究  75-86
  5.1 前言  75
  5.2 材料与方法  75-79
    5.2.1 菌种  75-76
    5.2.2 主要仪器  76
    5.2.3 主要药品  76
    5.2.4 主要试剂  76-77
    5.2.5 培养基  77
    5.2.6 假丝酵母的培养  77
    5.2.7 菌株Q210 的种子培养  77
    5.2.8 菌株Q210 的发酵培养  77-78
    5.2.9 发酵上清滤液的制备  78
    5.2.10 菌体破碎上清滤液的制备  78
    5.2.11 活性物质测定方法  78
      5.2.11.1 管碟法  78
      5.2.11.2 摇瓶发酵法  78
      5.2.11.3 体外酶反应检测法  78
    5.2.12 发酵液菌体浓度和核黄素含量测定方法  78-79
  5.3 结果与讨论  79-84
    5.3.1 活性物质存在位置的研究  79
    5.3.2 活性物质的极性试验  79-80
    5.3.3 活性物质的热稳定性试验  80-81
    5.3.4 活性物质的酸碱稳定性试验  81-82
    5.3.5 活性物质对蛋白酶K 的敏感性试验  82-83
    5.3.6 冰箱储存时间对活性物质稳定性的影响  83
    5.3.7 活性物质的硫酸铵盐析  83-84
  5.4 本章小结  84
  参考文献  84-86
第六章菌株Q210 发酵条件的研究  86-94
  6.1 前言  86-87
  6.2 材料与方法  87-89
    6.2.1 菌种来源  87
    6.2.2 主要仪器  87
    6.2.3 主要药品与试剂  87
    6.2.4 培养基  87-88
    6.2.5 假丝酵母的种子培养  88-89
    6.2.6 菌株Q210 的种子培养  89
    6.2.7 菌株Q210 的发酵培养  89
    6.2.8 活性物质的体外酶反应检测法  89
  6.3 结果与分析  89-93
    6.3.1 Q210 发酵培养基的研究  89-91
      6.3.1.1 培养基对菌株Q210 生长情况及菌落形态的影响  89-90
      6.3.1.2 培养基对Q210 活性产物合成的影响  90-91
    6.3.2 发酵时间对 Q210 活性产物合成的影响  91
    6.3.3 Q210 菌株发酵条件的正交试验结果  91-93
    6.3.4 正交试验验证结果  93
  6.4 本章小结  93-94
参考文献  94-95
第七章总结与展望  95-97
致谢  97-98
攻读学位期间发表的学术论文目录  98

核黄素生物合成抑制剂产生菌的筛选及研究

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