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抗人CD40单抗5C11抗原识别表位的初步研究

作　者: 张婷
导　师: 张学光
学　校: 苏州大学
专　业: 免疫学
关键词: CD40 抗原表位同源模建定点突变
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本课题以本所自行成功研制的鼠抗人CD40激发型单克隆抗体5C11为研究对象,借助计算机辅助分子设计与蛋白质空间结构模拟技术,利用抗原-抗体相互作用原理,计算机模拟得到抗原CD40与抗体5C11的主要结合位点,从而推测出抗体识别的抗原表位;结合文献报道的CD40-CD40L互相作用位点,通过定点突变技术、构建突变体基因转染细胞株等生物学实验方法,验证计算机模建结果的可靠性,从而确定抗体识别的抗原表位,对5C11抗体进行人源化改造或研制抗人CD40抗体临床用药具有理论和潜在的临床意义。目的:通过计算机模拟与生物实验,初步确定本所研制的抗人CD40激发型单抗5C11识别的抗原表位。方法:利用InsightⅡ软件分别模拟抗原、抗体结构,以及搭建抗原抗体复合物模型,通过计算并推测抗体所识别的抗原表位。通过RT-PCR的方法分别获得人野生型CD40(wtCD40)和70位突变(70muCD40)及114位突变(114muCD40)的全长基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40并进行鉴定;脂质体转染法将重组表达载体导入HEK293细胞;RT-PCR和FCM的方法鉴定重组表达载体;FCM、Western Blot法比较5C11分别与HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40基因转染细胞株的结合。结果:(1)搭建合理的抗原CD40胞外段与抗体5C11 Fv结构的复合物模型。(2)酶切和测序结果均证实成功构建3个真核表达载体;RT-PCR和FCM检测结果表明,表达载体成功转染入HEK293细胞。(3) FCM结果表明5C11与HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40结合较之与HEK293/wtCD40结合的平均荧光强度有减弱的趋势;Western blot检测结果表明5C11仅识别HEK293/wtCD40,不识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40。由此表明5C11识别HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40的能力降低。结论:预测5C11识别的抗原表位是15-17、23、43-56、68-80、85、87、100-115;成功构建HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40基因转染细胞株,证实人CD40序列的第70位苏氨酸和第114位谷氨酸是其单抗5C11识别的抗原表位,同时验证了计算机模建及预测结果的可靠性,为今后5C11抗体人源化改造的计算机辅助分子设计与实验研究奠定了良好的基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
研究背景  9-22
  1. CD40 的结构  9-11
  2. CD40 结构与功能的关系  11-13
  3. CD40 与肿瘤  13
  4. 抗 CD40 单抗在肿瘤生物治疗中的作用  13-15
  5. 抗人 CD40 单抗 5C11 的生物学作用  15
  6. 确定抗原表位的意义  15-16
  参考文献  16-22
第一部分 CD40抗原结构和5C11抗体Fv结构的同源模建及抗原抗体复合物模型的建立  22-32
  材料与方法  23-24
  结果  24-30
  讨论  30-31
  参考文献  31-32
第二部分单抗5C11 识别抗原表位的实验研究  32-50
  材料与方法  33-43
  结果  43-48
  讨论  48-49
  参考文献  49-50
小结和展望  50-52
  本研究获得以下成果  50-51
  展望  51-52
本研究所获的基金资助  52-53
研究生期间完成的论文  53-54
缩略词表  54-56
致谢  56-58

抗人CD40单抗5C11抗原识别表位的初步研究

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