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耐酸性黑曲霉木聚糖酶XynⅢ的改造和定点突变研究

作　者: 黄中璞
导　师: 刘亮伟
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 木聚糖酶 定点突变 最适pH 重叠延伸PCR
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


木聚糖酶拥有非常广泛的应用价值,在造纸、酿造、饲料、食品和能源等行业的应用价值已经得到了充分的肯定,如用于纸浆生物漂白,改善环境污染,在饲料中添加后还可以改善其营养价值。工业上应用的木聚糖酶在pH值范围上有着不同的要求,很多都需要其在较低的pH环境下进行作用,例如在饲料工业中,就要求木聚糖酶在较低的pH值范围内作为饲料添加剂。但是很多天然的木聚糖酶耐酸性不高,这就为它们在饲料、环境保护等行业中应用设置了障碍。所以,对木聚糖酶耐酸性的改良十分必要。本实验室筛选的木聚糖酶为高产菌株,但是由于pMD19-T Vector上多了一个NdeI酶切位点,导致基因前端多了一段带有起始密码子的大约200个碱基的序列,这样表达的时候就可能对产生的木聚糖酶造成影响,在本实验中,我通过PCR的方法将前端多余的序列去除,重新连在pET-20b表达载体上,发现改造后的木聚糖酶的最适温度和温度稳定性较改造前的均有所提高,对酶活性质进行检测后,证明多出的一段多余序列对木聚糖酶的性质的确产生了十分显著的影响。由该酶分泌表达的β-1,4-内切木聚糖酶属于G/11家族,其最适反应pH为4.0,不适于在需要强酸性的生物工程环境下使用。根据我们前期得到的与G/11家族木聚糖pH相关氨基酸二连体的计算结果:pH=5.0-0.67*(YS)+1.22*(KR)+0.82*(MR)+0.34*(SY)。发现YS是与pH呈负相关的氨基酸。从XynⅢ氨基酸序列中查找与Y有关的氨基酸二联体,通过重叠延伸PCR的方法,把Y之后的氨基酸突变为S,即分别设计为与pH负相关的YS。进行组合突变,研究其在低pH环境下的酶活性质。用重叠延伸PCR对野生酶基因进行定点突变,分别对木聚糖酶基因的九个位点进行突变,再分别将这九个基因连接到T载体上。突变基因经过酶切、酶连、转化和电泳鉴定,目前得到1号、2号、4号突变基因克隆到表达载体pET-20b上。将含有突变基因的重组质粒转化入大肠杆菌中诱导表达,获得具有木聚糖酶活性的蛋白。通过对重组酶的酶学性质进行研究,我们发现:突变前的木聚糖酶的最适pH在4.0左右,在突变后了的1、2、4三个位点中,突变体酶2号与其相比并没有十分显著的变化,而突变体酶1的最适pH降低至3.6,突变体酶4的最适pH降低至3.8。这在一定程度上验证了我们当时的预测。

全文目录


摘要  7-81 文献综述  8-21  1.1 木聚糖酶的分类与应用  8-12    1.1.1 木聚糖酶在饲料工业中的应用  9-10    1.1.2 木聚糖酶在造纸产业中的应用  10    1.1.3 木聚糖酶在食品工业中的应用  10-11    1.1.4 木聚糖酶在能源方面及其他方面的应用  11-12  1.2 木聚糖酶的分类和蛋白质结构  12-14    1.2.1 木聚糖酶的进化  12    1.2.2 木聚糖酶的蛋白质结构  12-14  1.3 木聚糖酶的分子改造方法  14-21    1.3.1 重叠延伸 PCR 法  14-16    1.3.2 DNA 改组技术  16    1.3.3 交错延伸技术  16-17    1.3.4 体外随机引发重组  17    1.3.5 蛋白融合  17-18    1.3.6 引入突变构建二硫桥  18-19    1.3.7 改造信号肽  19    1.3.8 定点突变  19-20    1.3.9 化学修饰  20    1.3.10 其他  20-212 引言  21-223 材料与方法  22-33  3.1 材料  22-24    3.1.1 菌株和载体  22    3.1.2 试剂与药品  22    3.1.3 培养基  22-23    3.1.4 仪器设备  23-24  3.2 实验流程  24-26    3.2.1 原有 pET20b- XynⅢ模板的改造  24-25    3.2.2 突变体构建与酶学性质分析  25-26  3.3 实验方法  26-33    3.3.1 对 pET20b- XynⅢ的改造  26-27    3.3.2 突变体的构建  27-32    3.3.3 各突变体质粒热击转化大肠杆菌 BL-21  32    3.3.4 突变基因在大肠杆菌中的表达与检测  32    3.3.5 改造后的 pET20b- XynⅢ和重组木聚糖酶的酶学性质分析  32-334 结果与分析  33-41  4.1 对 pET20b- XynⅢ模板进行改造和突变体基因的 PCR 扩增  33-36    4.1.1 改造 pET20b-XynⅢ模板  33    4.1.2 突变体基因的 PCR 扩增  33-36  4.2 含突变位点的重组质粒的鉴定  36-37  4.3 突变基因的测序与序列比对  37-38  4.4 突变基因在大肠杆菌中的诱导表达  38  4.5 改造后的 pET20b-XynⅢ和重组木聚糖酶的酶学性质  38-41    4.5.1 改造后的 pET20b-XynⅢ酶的热稳定性  38-39    4.5.2 改造前、后的 pET20b- XynⅢ酶的最适温度  39    4.5.3 重组酶的最适 pH  39-415 结论与讨论  41-44  5.1 结论  41  5.2 讨论  41-43  5.3 后续工作  43-44    5.3.1 完成其他突变位点的改造  43    5.3.2 进一步改造木聚糖酶的温度稳定性  43-44参考文献  44-49英文摘要  49-50致谢  50-51缩略语表  51

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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