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Rhodococcus sp.R04联苯水解酶性质及反应动力学研究

作　者: 李鹏丽
导　师: 杨秀清
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 多氯联苯联苯水解酶酶学性质定点突变停流光谱
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

多氯联苯(PCBs)是一种严重的环境污染物,它不断威胁着自然生态系统和人类健康。微生物治理多氯联苯环境污染具有环境破坏小、经济有效,且不会产生二次污染等特点而被人们广泛关注。水解酶BphD作为PCBs微生物降解途径中的关键酶,其结构和功能已成为该领域研究的热点。本文从一株联苯降解菌株Rhodococcus sp. R04的基因组中扩增水解酶基因bphD,并将其克隆到表达载体pBV220中,构建了重组质粒pBV220-bphD。表达产物经离子交换和凝胶排阻两步层析,最后获得了电泳纯的BphD, SDS-PAGE和分子排阻层析表明它是一个亚基分子量为31 kD的同源四聚体。在此基础上,对BphD的部分酶学性质以及其圆二色性进行初步研究,同时对几种金属离子、表面活性剂和抑制剂等因素对BphD的影响做了进一步的分析。结果显示BphD的最适反应温度和最适pH分别为80℃和9。该酶在60℃温浴1 h,酶活剩余90%,而在70℃温浴时,半衰期为1h,是迄今为止在有关红球菌的报道中唯一一例热稳定性高的水解酶。BphD的圆二色谱在208nm和222nm为典型的双负峰,表明该酶是一个以a-helix占主导的蛋白,当温度升高到70℃时,其二级结构发生了明显的变化,80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。1 mmol/L的金属离子除Mn2+对BphD的活性有微弱促进作用之外,其它的对其活性均有不同程度的抑制,SDS对BphD的抑制作用也较为强烈。另外,该酶的金属依赖性不强,但其抗氧化能力相对较强。利用圆二色谱技术进一步探讨了BphD的热稳定性与其二级结构的关系,结果表明该酶活性的高低依赖于其二级结构的完整性。随着反应温度的不断升高,该酶的的二级结构逐渐遭到破坏,此时酶活性表现出逐渐下降的趋势。对几种同源水解酶的一级结构进行比对,发现Ser、His、Asp以及Trp在所有的水解酶中完全保守,另外还发现S46、G53、V65、A180、V207、S213和M252等位置的氨基酸与其它几种水解酶相同位置的氨基酸不同,是红球菌R04 BphD所特有的序列。对BphD这些保守氨基酸残基进行特异性地化学修饰,结果显示它们对酶活影响较大,推测它们很可能在催化过程中担任重要角色,或者位于酶的活性中心。为进一步确定BphD保守氨基酸及特有氨基酸的功能,分别对它们进行了定点突变和表达。此外,对BphD的稳态和前稳态动力学进行初步研究。以HOPDA作为底物时,BphD的Km为0.44μmol/L, kcat为2.8 s-1。儿茶酚类的物质不能作为BphD的底物；联苯类物质中HOPDA是最适底物,且BphD对氯代HOPDA的降解受到氯原子取代数目的影响。利用停流光谱技术跟踪了BphD对底物HOPDA的水解历程。底物HOPDA在反应之初迅速地消耗,最终达到恒定水平；酶-底物复合物在反应初始阶段迅速地生成,然后又急速地分解,最后逐渐趋于平衡；产物HPD随着反应时间的延长逐渐增多,并达到一个平衡状态,此时酶促反应达到稳态水平,整个反应符合典型的酶促反应动力学；且反应温度和酶浓度的升高都会加速各反应元件达到稳态水平。这为进一步研究水解酶的动力学机制奠定了基础。

全文目录

摘要 10-12ABSTRACT 12-14第一章文献综述 14-27 1 联苯及其衍生化合物 14-18 1.1 芳香族化合物概述 14 1.2 联苯及其衍生物概况 14-16 1.3 联苯及其衍生物的危害及治理 16-18 2 联苯及多氯联苯的生物降解 18-21 2.1 联苯的生物降解 18-19 2.2 多氯联苯的生物降解 19 2.3 联苯及多氯联苯降解的上游酶系 19-21 3 HOPDA 21-22 3.1 HOPDA的产生和积累 21 3.2 HOPDA的生物转化工程 21-22 4 本论文研究的目的和意义 22-23 参考文献 23-27第二章联苯水解酶基因的克隆,表达和纯化 27-36 1 材料 27-28 1.1 菌株和载体 27-28 1.2 培养基 28 1.3 主要的酶和化学试剂 28 1.4 主要的仪器设备 28 2 方法 28-32 2.1 Rhodococcus sp.R04水解酶基因bphD的克隆 28 2.2 联苯水解酶的表达 28-30 2.3 联苯水解酶的纯化 30-31 2.4 酶活性分析及蛋白含量测定 31-32 3 结果 32-33 3.1 Rhodococcus sp.R04水解酶基因bphD的扩增及重组子鉴定 32 3.2 联苯水解酶的表达及纯化 32-33 4 讨论 33-34 参考文献 34-36第三章联苯水解酶的部分性质研究 36-47 1 材料 36-37 1.1 主要的化学试剂 36 1.2 主要的仪器设备 36-37 2 方法 37-39 2.1 最适pH和最适温度测定 37 2.2 pH稳定性和热稳定性测定 37-38 2.3 圆二色性分析 38 2.4 天然分子量的测定 38 2.5 金属离子、表面活性剂和抑制剂对BphD酶活性的影响 38 2.6 动力学参数的测定 38-39 3 结果 39-43 3.1 BphD最适温度和最适pH 39 3.2 BphD的pH稳定性 39 3.3 BphD的热稳定性 39-40 3.4 BphD的圆二色性 40-41 3.5 BphD的天然分子量 41-42 3.6 金属离子、表面活性剂和抑制剂对BphD活性的影响 42 3.7 BphD的动力学参数 42-43 4 讨论 43-44 参考文献 44-47第四章联苯水解酶的催化活性氨基酸分析及定点突变研究 47-57 1 材料 47-48 1.1 主要的酶和化学试剂 47-48 1.2 主要仪器设备 48 2 方法 48-51 2.1 Rhodococcus sp.R04 BphD与其同源水解酶的氨基酸系列比对 48 2.2 Rhodococcus sp.R04 BphD的化学修饰 48 2.3 联苯水解酶的定点突变 48-50 2.4 突变体重组质粒的构建 50 2.5 BphD突变体的表达 50-51 3 结果 51-54 3.1 水解酶一级结构序列比对 51 3.2 BphD的化学修饰 51-53 3.3 BphD的定点突变及突变体的表达 53-54 4 讨论 54-55 参考文献 55-57第五章联苯水解酶反应动力学研究 57-69 1 材料 58-59 1.1 菌株来源 58 1.2 试剂与仪器 58 1.3 培养基 58-59 2 方法 59-60 2.1 2,3-二羟基联苯双加氧酶的制备 59 2.2 联苯水解酶的制备 59 2.3 BphD稳态动力学数据测定 59 2.4 BphD的底物特异性分析 59-60 2.5 BphD非稳态动力学研究 60 3 结果与讨论 60-66 3.1 BphD稳态动力学分析 60-63 3.2 BphD非稳态动力学分析 63-66 4 展望 66 参考文献 66-69小结 69-70攻读学位期间取得的研究成果 70-71致谢 71-72个人简况及联系方式 72-74

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