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近平滑假丝酵母新型（S）-羰基还原酶基因克隆及高效表达

作　者: 耿亚维
导　师: 徐岩
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: (S)-羰基还原酶 基因克隆 生物转化 定点突变 全细胞催化剂 共表达
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 35次
引　用: 1次
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内容摘要


羰基还原酶（EC 1.1.1.184）具有高度的化学、区域和立体选择性,是一种极具潜力的催化不对称还原反应的生物催化剂,开展新型微生物羰基还原酶克隆表达研究对于开发工业目标羰基还原酶,丰富酶催化反应的分子机理具有重要的理论价值和实践意义。本研究从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CCTCC M203011）基因组中钓取了新型（S）-羰基还原酶基因scrⅡ,于Escherichia coli BL21和Pichia pastoirs GS115中高效表达。以2-羟基苯乙酮为底物,系统研究了重组酶的酶学性质,优化了生物转化反应条件,并将6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）引入（S）-羰基还原酶反应体系,实现辅酶再生循环,获得了新型高效的细胞生物催化体系。具体内容包括:（1）序列比对结果表明C. Parapsilosis基因组中有一段可能的羰基还原酶基因scrⅡ,该基因与scr（GenBank ID:DQ675534）相似性为85%,基因全长为840 bp,编码279个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示SCRⅡ包含典型性短链醇脱氢酶的两大功能域:辅酶结合保守序列Thr40-Gly41-（X）3-Gly45-X-Gly47和催化三元结构Ser172-（X）n-Tyr187-（X）3-Lys191（X为任意氨基酸）,表明该酶属于短链醇脱氢酶家族。（2）（S）-羰基还原酶（SCRⅡ）在大肠杆菌中过量表达,以10% （w/v）的重组菌为催化剂,6 g/L的2-羟基苯乙酮为底物,转化产物（S）-苯基乙二醇（PED）的光学纯度为99.1% e.e.,得率为89.6%。（3）纯化后的重组酶EcSCRⅡ比活为6.12 U/mg。EcSCRⅡ不对称还原2-羟基苯乙酮的最适pH和温度分别为6.0和35°C;酶在pH 5.0～7.0条件下稳定性较好,当温度不高于40°C时,酶活几乎不受影响。而一些金属离子Co2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+对酶活有一定的抑制作用。（4）蛋白质四级结构分析表明Ala220和Glu228位于酶催化域附近,A220和E228氨基酸突变导致酶活力几乎全部丧失,催化效率（Kcat/Km）仅为野生型SCRⅡ的7%左右。（5）为获得更高效的全细胞催化剂,本研究构建了SCRⅡ的重组毕赤酵母菌P. pastoris/pPIC3.5K-scrⅡ,10% （w/v）的重组菌催化还原6 g/L的2-羟基苯乙酮,反应24 h后,产物（S）-苯基乙二醇的光学纯度高达100% e.e,得率为93.1%。与重组大肠杆菌相比较,不仅催化效率获得提高,而且反应时间缩短了一半。（6）为提高全细胞催化不对称还原反应的批次稳定性,本研究成功将酿酒酵母的G6PDH基因ZWF1整合至毕赤酵母P. pastoris/pPIC3.5K-scrⅡ的基因组中,构建了SCRⅡ和G6PDH共表达的重组菌P. pastoris/SCRⅡG。在5% （w/v）葡萄糖的参与下,P. pastoris/SCRⅡG不对称还原2-羟基苯乙酮的催化稳定性大大提高,全细胞重复利用10个批次后,产物（S）-PED的光学纯度和得率始终维持在100%和85%以上。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章 绪论  10-20
  1.1 羰基还原酶概述  10
  1.2 羰基还原酶在不对称合成手性化合物上的应用  10-12
    1.2.1 手性醇类化合物  10-11
    1.2.2 羰基还原酶不对称还原制备手性醇类化合物  11
    1.2.3 羰基还原酶在不对称还原反应上的特点  11-12
  1.3 开发不对称还原反应的新型生物催化剂的研究进展  12-13
  1.4 羰基还原酶基因克隆及表达  13-15
    1.4.1 羰基还原酶基因克隆  13-14
    1.4.2 表达系统  14
    1.4.3 利用基因工程重组菌合成手性化合物  14-15
  1.5 全细胞辅酶再生的策略  15-16
  1.6 酶分子催化中的关键氨基酸位点  16-17
  1.7 论文的研究内容  17-20
第二章 实验材料与方法  20-30
  2.1 实验材料  20-22
    2.1.1 菌株与质粒  20
    2.1.2 主要试剂  20-21
    2.1.3 培养基与溶液  21-22
    2.1.4 主要仪器  22
  2.2 实验方法  22-30
    2.2.1 大肠杆菌原核表达系统的构建  22-25
    2.2.2 毕赤酵母（P. pastoris）真核表达系统的构建  25-26
    2.2.3 共表达毕赤酵母（P. pastoris）系统的构建  26
    2.2.4 重组蛋白的分离纯化及酶学性质的确定  26-28
    2.2.5 重组菌全细胞不对称还原反应  28
    2.2.6 SCRⅡ酶分子的分子改造  28-29
    2.2.7 动力学分析  29-30
第三章 结果与讨论  30-53
  3.1 新型(S)-羰基还原酶基因scrⅡ及氨基酸序列的分析  30-31
    3.1.1 基因scrⅡ的序列  30
    3.1.2 (S)-羰基还原酶SCRⅡ的氨基酸序列分析  30-31
  3.2 (S)-羰基还原酶在大肠杆菌中的克隆表达及重组菌的不对称转化  31-36
    3.2.1 基因scrⅡ的PCR 扩增  31
    3.2.2 克隆质粒T-scrⅡ的构建与酶切鉴定  31
    3.2.3 表达质粒pET28a- scrⅡ的构建与酶切鉴定  31-32
    3.2.4 重组蛋白的IPTG 诱导表达  32-33
    3.2.5 重组大肠杆菌不对称生物转化  33-34
    3.2.6 诱导剂IPTG 浓度对重组蛋白表达的影响  34
    3.2.7 诱导温度对蛋白表达量及重组菌不对称转化的影响  34-35
    3.2.8 pH 值对重组菌转化反应的影响  35-36
    3.2.9 温度对重组菌转化反应的影响  36
  3.3 重组蛋白EcSCRⅡ的分离纯化及其酶学性质的鉴定  36-40
    3.3.1 表达于大肠杆菌的目标蛋白的纯化及其生物功能的验证  36-37
    3.3.2 酶反应的最适pH 及pH 稳定性的研究  37
    3.3.3 酶反应的最适温度及温度稳定性的研究  37-39
    3.3.4 金属离子对酶活的影响  39
    3.3.5 酶的底物选择性  39-40
  3.4 酶蛋白在不对称还原反应中的关键氨基酸位点的初步探讨  40-44
    3.4.1 序列和结构分析确定突变位点  40-41
    3.4.2 SOE-PCR 方法进行定点突变及突变子的表达  41-43
    3.4.3 突变酶的比活及不对称还原反应  43
    3.4.4 突变酶不对称还原2-羟基苯乙酮的动力学研究  43-44
  3.5 SCRⅡ在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达及重组菌的不对称转化  44-48
    3.5.1 表达质粒P. pastoris/pPIC3.5K-scrⅡ的构建及鉴定  44
    3.5.2 电转化毕赤酵母GS 115  44-45
    3.5.3 重组毕赤酵母阳性克隆的筛选及鉴定  45
    3.5.4 SCRⅡ在巴斯德毕赤酵母中的表达  45
    3.5.5 表达产物SDS-PAGE 分析  45-46
    3.5.6 重组毕赤酵母P. pastoris  46
    3.5.7 重组菌不对称还原2-羟基苯乙酮的批次反应  46-48
  3.6 SCRⅡ与G6PDH 在毕赤酵母中的共表达  48-53
    3.6.1 ZWF1 基因序列  48
    3.6.2 表达质粒pPICZα-ZWF1 的构建  48-49
    3.6.3 毕赤酵母P. pastoris/SCRⅡG 的构建  49
    3.6.4 SCRⅡ和G6PDH 在毕赤酵母中的共表达  49-50
    3.6.5 全细胞催化剂的不对称转化反应  50-51
    3.6.6 两种重组毕赤酵母不对称还原2-羟基苯乙酮的批次反应  51-53
主要结论和展望  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-60
附录  60-61

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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