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枯草芽孢杆菌rbsK基因和tkt基因的敲除对核黄素发酵的影响

作　者: 赵丽丽
导　师: 陈涛
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 枯草芽孢杆菌 rbsK基因 tkt基因 核黄素 前体物 LC-MS
分类号: TQ927
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本课题的研究内容是通过在枯草芽孢杆菌中敲除rbsK基因,减少核黄素生产途径的副产物,进而考查对核黄素产量的影响。同时,敲除tkt基因即构建转酮酶缺陷菌株,使rbsK的敲除不至于引起其他副产物支路通量的增加,影响发酵结果。rbsK基因在戊糖磷酸途径中表达核糖激酶,进一步催化D-核糖的生成。该基因的敲除理论上将造成D-核糖-5磷酸的积累。由于核黄素的生成需要两种直接前体物,其合成方程式为2DHPB+DARPP=Riboflavin,这两种前体物分别由核黄素生产的长途径和短途径提供,而D-核糖-5磷酸又是这两条途径必需的前体物。同时,为避免由于D-核糖生成支路的切断引起另一个方向酮糖生成支路通量的增大,减少不必要的副产物的生成,本实验设计方案敲除tkt基因。以rbsK基因的敲除为例:经PCR扩增得到的rbsK基因片段进行酶切,再与以同样内切酶切后的载体质粒pUC18在大肠杆菌中进行酶连,得到第一个重组质粒pUC18-rbsK;在pUC18-rbsK质粒的rbsK片段上选择合适的酶切位点进行酶切,再与同样酶切后的抗性基因(Spc、Kan抗性等)进行酶连,得到第二个重组质粒pUC18-rbsK-Spc或pUC18-rbsK-Kan,使rbsK基因不能完整表达而失活;构建成功的整合型敲除质粒pUC18-rbsK-Spc或pUC18-rbsK-Kan在枯草芽孢杆菌中双交换整合,利用插入的抗性基因对菌株进行抗性筛选,最终实现了在枯草芽孢杆菌中敲除rbsK基因的目的。同理,经一系列酶切、酶连、转化、筛选等操作后,在枯草芽孢杆菌中可实现tkt基因的敲除。本实验主要在核黄素生产菌株RH33、RH44中敲除rbsK基因和tkt基因,基因操作完成后,对新构建的工程菌与出发菌株进行考察对比。首先利用LC-MS手段检测基因敲出前后菌株的相关代谢物,即D-核糖,一系列酮糖等的相对变化,结果显示,两个基因缺陷的菌株不再合成D-核糖,相关酮糖(以7磷酸-景天庚酮糖为检测目标)的产生量也有了较大程度的降低;摇瓶发酵后,发现两个基因的敲除对RH44的影响明显大于RH33。其中,两基因缺陷的工程菌RH44(R- Spcr)摇瓶发酵72 h后,核黄素产量最高可达到4.98 g,比出发菌株提高了约14.5%。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章 文献综述  7-18
  1.1 核黄素的理化性质、功能和用途  7
  1.2 核黄素的生产现状及生产方法  7-9
    1.2.1 化学半合成法  8
    1.2.2 微生物发酵法  8-9
  1.3 Bacillus subtilis中核黄素的生物合成途径及主要酶的功能  9-12
    1.3.1 Bacillus subtilis中核黄素的生物合成途径  9-11
    1.3.2 核黄素操纵子结构及其基因所编码的酶的功能  11-12
  1.4 产核黄素Bacillus subtilis工程菌的构建和策略  12-15
    1.4.1 代谢模型的构建与模拟  12-13
    1.4.2 传统诱变及基因组重排技术  13-14
    1.4.3 增加核黄素操纵子的转录和表达  14-15
    1.4.4 增加前体物的供给或减少副产物形成  15
  1.5 本文选题背景和主要内容  15-18
第二章 实验材料与实验方法  18-33
  2.1 实验材料  18-24
    2.1.1 菌种和质粒  18-19
    2.1.2 主要实验仪器  19-20
    2.1.3 药品与试剂  20-22
    2.1.4 培养基  22-24
  2.2 实验方法  24-33
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  24-25
    2.2.2 大肠杆菌质粒的提取  25
    2.2.3 DNA片段的回收纯化  25
    2.2.4 PCR反应体系  25-26
    2.2.5 酶切体系  26-27
    2.2.6 载体质粒的去磷酸化  27
    2.2.7 酶连体系  27-28
    2.2.8 琼脂糖凝胶电泳  28
    2.2.9 转化方法  28-30
    2.2.10 菌落PCR验证重组质粒在枯草芽孢杆菌的转化  30
    2.2.11 菌体生长曲线的测定  30
    2.2.12 发酵和测定样品中各物质的含量  30-31
    2.2.13 rbsK和tkt基因敲除前后枯草芽孢杆菌代谢物变化  31-32
    2.2.14 引物  32-33
第三章 实验结果与讨论  33-54
  3.1 rbsK基因在枯草芽孢杆菌中的敲除  33-43
    3.1.1 rbsK基因的PCR扩增  33-35
    3.1.2 rbsK基因与载体质粒的酶切  35-36
    3.1.3 rbsK基因与载体质粒的酶连  36-37
    3.1.4 重组质粒pUC18-rbsK在大肠杆菌中的筛选验证  37-38
    3.1.5 在rbsK中插入抗性基因  38-42
    3.1.6 重组质粒在野生型枯草芽孢杆菌中转化及验证  42-43
  3.2 tkt基因在枯草芽孢杆菌的敲除  43-48
    3.2.1 重组质粒pDG1731-tkt的构建  43-45
    3.2.2 重组质粒pDG1731-tkt-Kan、pDG1731-tkt-Spc的构建  45-48
    3.2.3 重组质粒pDG1731-tkt-Kan、pDG1731-tkt-Spc在枯草芽孢杆菌中的转化  48
  3.3 枯草芽孢杆菌敲除rbsK基因与tkt基因前后分析对比  48-54
    3.3.1 LC-MS检测rbsK基因和tkt基因敲除前后代谢物变化  49-51
    3.3.2 rbsK基因和tkt基因敲除前后核黄素发酵产量的变化  51-54
第四章 结论与展望  54-56
  4.1 结论  54
  4.2 展望  54-56
参考文献  56-60
发表论文和参加科研情况说明  60-61
致谢  61

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