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γ-PGA酸水解测定法的改进及发酵产γ-PGA过程分子量分布和水解酶基因克隆的研究

作　者: 吴剑光
导　师: 钟卫鸿
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: γ-聚谷氨酸枯草芽孢杆菌 SDS-凝胶电泳 ywtD
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

γ-PGA（γ-聚谷氨酸）是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，是一种通过微生物合成，由谷氨酸单体以γ-羧基与氨基相缩合而成的均聚氨基酸化合物。以实验室从纳豆中自行分离出来的γ-聚谷氨酸（γ-PGA）高产菌株Bacillus subtilis ZJUTZY为研究对象，进行了Bacillus subtilis ZJUTZY发酵产物γ-PGA检测方法的修正；考察了培养时间和不同碳源对γ-PGA产量以及其分子量分布变化情况；最后考察了Bacillus subtilis ZJUTZY对γ-PGA的降解，并进行了水解酶基因ywtD的克隆。测定γ-PGA最常利用的方法是酸水解法，但酸水解法测定γ-PGA周期长且步骤多，本实验室发现醇沉过程和水解液的pH中和步骤会导致实验结果错误。本论文通过增测醇沉物水溶指标，消除了醇沉步骤中谷氨酸晶体沉淀析出带来的影响；通过控制水解液中和步骤中NaOH的添加量，减小了γ-PGA的水解定量检测方法的实验误差。另外通过比较生物传感仪SBA与高效液相色谱测得的γ-PGA产量数据，发现Bacillus subtilis ZJUTZY合成的γ-PGA主要是由L-谷氨酸组成的，因此可以利用生物传感仪(酶电极只测L-谷氨酸)来代替HPLC测定γ-PGA产量。然后利用SBA检测了Bacillus subtilis ZJUTZY发酵产γ-PGA过程曲线，发现Bacillus subtilis ZJUTZY发酵产γ-PGA的产量在30 h开始出现下降。同时用SDS-PAGE考察了分子量分布的变化情况，分子量分布也有相应变化，具体原因有待考察；检测了不同碳源对Bacillussubtilis ZJUTZY发酵产γ-PGA产量以及分子量分布的影响，发现碳源对γ-PGA产量和γ-PGA分子量分布均有影响。针对Bacillus subtilis ZJUTZY发酵产γ-PGA过程曲线中30 h后出现的产量下降现象，考察了Bacillus subtilis ZJUTZY在γ-PGA为唯一营养物质的培养基中生长和对γ-PGA的水解作用，发现其确实存在水解功能。根据文献和Genebank数据库中已有的γ-PGA水解酶基因报道，Bacillus subtilis ZJUTZY的γ-PGA水解酶核心基因很可能为ywtD，据此，设计了1组正反向引物ywtD-F和ywtD-R，以Bacillus subtilisZJUTZY基因组DNA为模板时，PCR获得了一段长1376bp的基因片段，对PCR片段进行序列测定，发现该基因片段与多种Bacillus subtilis菌株的ywtD基因具有较高的同源性，相似度达到了99%，故可初步认定PCR得到的DNA片段为ywtD基因的目标序列。结果表明Bacillussubtilis ZJUTZY确实有水解酶基因，水解酶可能就是Bacillus subtilisZJUTZY发酵产γ-PGA时产量下降拐点的原因。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章文献综述  10-22
  1.1 Γ-PGA的结构和性质  10-12
    1.1.1 γ-PGA的结构  10
    1.1.2 γ-PGA的性质  10-12
  1.2 Γ-PGA的制备  12
    1.2.1 化学法合成  12
    1.2.2 提取法合成  12
    1.2.3 微生物发酵合成法  12
  1.3 Γ-PGA相关基因  12-14
    1.3.1 γ-PGA合成酶相关基因  12-14
    1.3.2 γ-PGA水解酶相关基因  14
  1.4 Γ-PGA可能的合成机理  14-18
    1.4.1 底物谷氨酸的来源  14-15
    1.4.2 γ-PGA的聚合机制  15-16
    1.4.3 γ-PGA合成酶组分的功能  16-17
    1.4.4 γ-PGA的合成调控  17-18
  1.5 Γ-PGA的应用  18-20
    1.5.1 医药应用  18-19
    1.5.2 化妆用品与日用品  19
    1.5.3 农业应用  19-20
    1.5.4 其他应用  20
  1.6 本论文的研究内容及意义  20-22
第二章实验材料与方法  22-28
  2.1 仪器与试剂  22-23
    2.1.1 主要仪器  22
    2.1.2 主要试剂及标准品  22-23
  2.2 培养基和培养条件  23-24
    2.2.1 主要培养基  23
    2.2.2 培养方法  23-24
  2.3 分析测定方法  24-28
    2.3.1 pH则定  24
    2.3.2 菌体量测定  24
    2.3.3 γ-PGA粗品的制备  24-25
    2.3.4 γ-PGA产量的测定方法  25-26
    2.3.5 FDNB法的建立  26-28
第三章 γ-PGA酸水解定量检测方法的改进  28-40
  3.1 前言  28
  3.2 材料与方法  28-31
    3.2.1 菌种  28-29
    3.2.2 培养基和培养条件  29
    3.2.3 酸水解法的修正  29-31
    3.2.4 SBA与HPLC测定结果的相关性  31
  3.3 结果与讨论  31-38
    3.3.1 初始酸水解法检B.SUBTILISZJUTZY转化生产Γ-PGA的产量结果  31-32
    3.3.2 改进醇沉后酸水解法检测BSUBTLISZJUTZY转化生产Γ-PGA的产量结果  32-34
    3.3.3 中和步骤中NAOH 添加量对酸水解法检测结果的影响  34-36
    3.3.4 改进前后酸水解法测定结果的对比  36-37
    3.3.5 SBA与HPLC测定Γ-PGA产量结果的相关性  37-38
  3.4 小结  38-40
第四章 BACILLUS SUBTILISZJUTZY发酵产Γ-PGA 过程分子量分布研究  40-53
  4.1 前言  40
  4.2 材料与方法  40-47
    4.2.1 菌种及培养基  40-42
    4.2.2 主要药品  42-43
    4.2.3 主要仪器设备  43-44
    4.2.4 主要试剂  44
    4.2.5 培养方法  44-45
    4.2.6 实验方法  45-47
  4.3 结果与讨论  47-52
    4.3.1 发酵产γ-PGA 过程中不同时间点其产量及分子量分布的变化情况  47-50
    4.3.2 发酵产γ-PGA 过程中不同碳源对其产量及分子量分布的影响  50-52
  4.4 小结  52-53
第五章 BACILLUS SUBTILISZJUTZYr对Γ-PGA的水解及水解酶基因YWTD 的克隆  53-66
  5.1 前言  53-54
  5.2 材料与方法  54-59
    5.2.1 菌种与质粒  54
    5.2.2 培养基  54
    5.2.3 DNA操作工具酶和试剂盒  54-55
    5.2.4 抗生素  55
    5.2.5 PCR引物  55
    5.2.6 Bacillus subtilis ZJUTZY对γ-PGA的水解作用  55
    5.2.7 Bacillus subtilis ZJUTZY基因组的提取  55-56
    5.2.8 PCR反应扩增水解酶基因ywtD  56-57
    5.2.9 DNA的检测  57
    5.2.10 琼脂糖电泳后所需DNA 片段的回收  57
    5.2.11 PCR 反应产物片断与pMD19-T vector的连接  57-58
    5.2.12 E.coli DH 5α感受态细胞的制备  58
    5.2.13 转化E.coli DH 5α感受态细胞  58-59
  5.3 结果与讨论  59-64
    5.3.1 Bacillus subtilis ZJUTZY对γ-PGA的水解作用  59-60
    5.3.2 ywtD  60-64
      5.3.2.1 PCR引物的设计  60-62
      5.3.2.2 ywtD部分基因片段的克隆  62-63
      5.3.2.3 ywtD部分基因片段的鉴定  63-64
  5.4 小结  64-66
第六章结论与展望  66-68
  6.1 论文的主要研究结论  66-67
  6.2 展望  67-68
参考文献  68-74
致谢  74-75
攻读学位期间发表的学术论文  75

γ-PGA酸水解测定法的改进及发酵产γ-PGA过程分子量分布和水解酶基因克隆的研究

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