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Bacillus subtilis fmbj对桃软腐病菌Rhizopus stolonifer拮抗机理及应用研究

作　者: 周小虹
导　师: 别小妹
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 枯草芽孢杆菌fmbj 桃软腐病菌营养物质生物防治
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

果品采后贮藏期的损失是十分惊人的,我国常见水果的损失可达20-50%,其中桃软腐病菌即葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)在我国桃果产区普遍发生,所造成的大量烂果已成为生产上的突出问题。目前,控制这类病害的方法仍以化学杀菌剂为主,但随着其产生的耐药性、环境污染等问题的日益严重以及生防技术的不断推广,水果采后生物防治的研究越来越受到重视。而关于如何提高微生物拮抗菌抑菌效果已成为近年来科学家们研究的热点。菌(?)(?)Bacullus subtilis fmbj是本实验室分离筛选得到的,经研究证明该菌株能够产生脂肽类抗生素surfactin和fengincin,对多种真菌、细菌及病毒都具有广谱抑制效果。本研究的目的在于探讨该菌株对引起桃果采后软腐病害的R.stolonifer的抑制机理；通过筛选营养物质以及与拮抗酵母菌株建立微生物菌群来提高B.subtilis fmbj对R.stolonifer的生防效果,最终为该菌株实际的应用提供理论依据。论文的主要研究内容和结论如下：1.采用对峙培养法检测了B.subtilis fmbj对桃软腐病菌R.stolonifer的拮抗作用,研究了不同浓度B.subtilis fmbj对R.stolonifer菌丝及孢子生长的抑制效果,同时采用了SEM和TEM观察B.subtilis fmbj对R.stolonifer菌丝和孢子超微结构的破坏作用。结果表明：B.subtilis fmbj对R.stolonifer表现了良好的拮抗效果,且对R.stolonifer的菌丝生长,孢子形成和萌发均有显著的抑制效果。电镜观察显示：经过处理后的菌丝、孢子受到严重破坏,生长畸形,胞内物质外泄而死亡。2.研究了20种N源、16种C源以及16种矿物质离子对于病原菌R.stolonifer菌丝生长、孢子萌发及对拮抗菌B.subtilis fmbj生长的影响。并从三类营养物质中筛选出能最大促进拮抗菌的生长,且对病原菌无明显促进作用的因子,通过对C源、N源和矿物质离子进行优化,筛选出对拮抗菌有最大促进作用,和对病原菌无明显促进作用的营养组合,考察了在此营养组合下B.subtilis fmbj对桃果实采后软腐病(R.stolonifer)的防治效果。离体试验表明,NaHC03/麦芽糖/组氨酸盐酸盐组合对B.subtilis fmbj有明显促进作用但对R.stolonifer无促进作用,而FeCl3/鼠李糖/苏氨酸组合对于对B.subtilisfmbj有明显促进作用,对R.stolonifer生长有抑制作用。活体实验发现,B.subtilis fmbj在这两种营养因子组合下明显优于菌株单独使用该营养因子时对桃采后软腐病的防治效果。3.分别从离体和活体研究了2-DOG对拮抗菌B.subtilis fmbj和病原菌R.stolonifer生长的影响及该拮抗菌与不同浓度的2-DOG协同作用对桃果实采后软腐病的防治效果。离体实验表明,2-DOG浓度仅为0.3mg/ml时,就可完全抑制R.stolonifer的生长,而2-DOG高达20mg/ml,拮抗菌依然存活,表现出对2-DOG较高的耐受性。活体实验发现,单独使用浓度为3.9×108CFU/ml的B.subtilis fmbj时,桃果实发病率为30%；4mg/ml的2-DOG单独使用时桃果实发病率为35%；而当4mg/ml的2-DOG和3.9×107CFU/ml的B.subtilis fmbj协同作用时,可完全抑制果实的腐败。4.对本实验室拥有的13株酵母菌进行拮抗力测试,发现有五株对病原菌R.stolonifer有一定的拮抗作用,其中以菌株A82-2及罗伦隐球酵母最为明,并采用了26srDNA对A82-2进行鉴定,实验又进一步将菌株A82-2及罗伦隐球酵母分别与B.subtilis fmbj按不同的浓度混菌共培养,发现酵母与B.subtilis fmbj之间虽然有一定的营养竞争,但是依然能够协同共生,尤其是菌株A82-2与B.subtilis fmbj协同共生效果良好,形成稳定的微生物菌群。B.subtilis fmbj与菌株A82-2协同后,明显提高了对R.stolonifer菌丝生长的抑制率。

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图形索引 7-9表格索引 9-11摘要 11-13ABSTRACT 13-15第一章文献综述 15-29 前言 15 1 桃果实软腐病的研究概况 15-18 1.1 桃软腐病的病原、病症及发病规律 15-16 1.2 桃软腐病的防治措施 16-17 1.3 国内外对桃软腐病的研究进展 17 1.4 存在问题 17-18 2 枯草芽孢杆菌的作用机理 18-20 3 提高生防效果的措施 20-22 3.1 使用佐剂 20 3.2 不同拮抗菌的混合使用 20-21 3.3 与某些金属离子混合使用 21 3.4 与其它物质和措施结合 21-22 4 拮抗菌剂的应用现状及存在问题 22-23 4.1 应用现状 22-23 4.2 存在问题 23 5 课题来源及意义 23-24 参考文献 24-29第二章 Bacillus subtilis fmbj对Rhizopus stolonifer菌丝生长和孢子萌发的影响 29-39 1 材料与方法 29-31 1.1 材料 29-30 1.2 方法 30-31 2 结果与分析 31-36 2.1 B.subtilis fmbj对R.stolonifer的拮抗效果 31-32 2.2 B.subtilis fmbj对R.stolonifer菌丝生长的影响 32 2.3 B.subtilis fmbj对R.stolonifer孢子形成的影响 32-33 2.4 B.subtilis fmbj对R.stolonifer孢子萌发的影响 33 2.5 B.subtilis fmbj对R.stolonifer菌丝及孢子结构形态的影响 33-36 3 讨论 36 4 本章小结 36 参考文献 36-39第三章 Bacillus subtilis fmbj与营养物质协同作用对Rhizopus stolonifer的抑菌效果研究 39-55 1 材料和方法 39-42 1.1 材料 39-40 1.2 方法 40-42 2 结果与分析 42-51 2.1 C源、N源及矿物质元素对拮抗菌B.subtilis fmbj及病原菌R.stolonifer生长的影响 42-46 2.2 C源、N源及矿物质元素优化组合 46-48 2.3 不同的营养因子及组合下B.subtilis fmbj对桃果实软腐病的生防效果 48-50 2.4 不同营养液在体内条件下对拮抗菌生长的影响 50-51 3 讨论 51-52 4 本章小结 52 参考文献 52-55第四章 Bacillus subtilis fmbj与2-脱氧葡萄糖协同作用对Rhizopus stolonifer的生物防治效果研究 55-65 1 材料与方法 56-58 1.1 材料 56-57 1.2 方法 57-58 2 结果与分析 58-62 2.1 2-DOG在离体条件下对病原菌R.stolonifer生长的影响 58-59 2.2 2-DOG在离体条件下对拮抗菌B.subtilis fmbj菌株生长的影响 59 2.3 B.subtilis fmbj与2-DOG协同在活体条件下对桃果实软腐病的防治效果 59-61 2.4 2-DOG对B.subtilis fmbj在桃果实伤口处生长量的影响 61-62 3 讨论 62 4 本章小结 62-63 参考文献 63-65第五章 Bacillus subtilis fmbj和酵母菌协同共生对Rhizopus stolonifer的抑菌效果研究 65-81 1 材料与方法 65-70 1.1 材料 65-66 1.2 方法 66-70 2 结果与分析 70-77 2.1 对R.stolonifer有拮抗作用的酵母菌的筛选 70 2.2 酵母菌株A82-2的分类鉴定 70-73 2.3 异常毕赤酵母及罗伦隐球酵母对R.stolonifer菌丝生长的影响 73-74 2.4 抗生素对B.subtilis fmbj和酵母菌的毒性测定 74-75 2.5 B.subtilis fmbj和酵母菌协同共生研究 75-77 2.6 B.subtilis fmbj协同拮抗酵母对R.stolonifer菌丝生长的影响 77 3 讨论 77-78 4 本章小结 78 参考文献 78-81全文结论 81-83创新点 83-85硕士期间发表文章 85-87致谢 87

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