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甜菜夜蛾cDNA文库的构建及几丁质合成酶基因片段的克隆

作　者: 孙小洁
导　师: 李庆；张文庆
学　校: 四川农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甜菜夜蛾 cDNA文库几丁质合成酶克隆
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 235次
引　用: 1次
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内容摘要

几丁质是昆虫表皮（外骨骼）的主要成分,也是许多昆虫肠道表皮的重要成分,在昆虫中起到肌肉着生点、保护内脏器官和防止水分蒸发的作用,并且可以防止有害物质的入侵。几丁质合成酶（CHS）介导几丁质的合成。由于CHS表达的不稳定性,迄今只有黑腹果蝇、烟草天蛾、冈比亚按蚊等七种昆虫的CHS全长基因得到了克隆。构建cDNA文库不但可以快速、高效地克隆未知基因,而且有利于我们进一步研究基因功能。本实验以甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）5龄幼虫为材料,采用Invitrogen公司FastTrack（?） 2.0 Kit for isolation of mRNAs试剂盒一步法直接提取mRNA,经紫外分光光度计检测OD₂₆₀/OD₂₈₀=2,质量为10.24μg,说明提取的mRNA不论从纯度还是含量都可以很好地满足实验要求。采用Stratagene公司的ZAP Express（?） cDNA Synthesis Kit以及ZAP Express（?） cDNA Gigapack（?） Ⅲ Gold Cloning Kit构建了甜菜夜蛾cDNA表达文库。将合成的双链cDNA通过Sepharose CL-2B去除400bp以下的小片段,有效地保证了文库中所包含的长序列的丰度。经检测文库的初始滴度为1.1×10⁵pfu/ml,重组率为97%,扩增后文库的滴度为5.4×10⁷pfu/ml,完全符合cDNA文库的要求。以文库为模板克隆几丁质合成酶Ⅰ的部分序列（988bp）,与本实验已获得的几丁质合成酶基因进行序列拼接,得到5207bp的序列,其开放读码框长4698bp。经序列分析,该序列与烟草天蛾（Manduca sexta）MsCHS1的同源性最高,达到91%。与其它昆虫CHS的同源性也较高。经序列分析、比对,我们认定该序列为甜菜夜蛾几丁质合成酶SeCHSA全长序列（GenBank登录号为NO:DG062153）。

全文目录

中文摘要  6-7
Abstract  7-8
第一章前言  8-15
  1．甜菜夜蛾及其危害  8-9
  2．基因文库  9-12
  3．昆虫几丁质合成酶基因  12-15
第二章甜菜夜蛾幼虫mRNA的提取  15-20
  1．材料与仪器设备  15-16
  2．实验方法  16-17
  3．结果与分析  17-18
  4．讨论  18-20
第三章甜菜夜蛾cDNA文库的构建  20-40
  1．材料与仪器设备  20-21
  2．实验方法  21-34
  3．结果与分析  34-37
  4．讨论  37-40
第四章甜菜夜蛾几丁质合成酶基因片段的克隆与全长序列分析  40-54
  1．材料与仪器设备  40-41
  2．实验方法  41-42
  3．结果与分析  42
  4．几丁质合成酶基因片段测序与全长序列分析  42-50
  5．结论与讨论  50-54
参考文献  54-58
致谢  58-59
缩略词  59-60
攻读学位期间发表的学术论文目录  60

甜菜夜蛾cDNA文库的构建及几丁质合成酶基因片段的克隆

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