学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

成骨细胞中肌动蛋白对cAMP调节的L-型钙通道的作用及其分子机制

作　者: 李芳萍
导　师: 张雪梅
学　校: 复旦大学
专　业: 药理学
关键词: L-型钙通道肌动蛋白解聚聚合 cAMP Actinin4 成骨细胞
分类号: R966
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 53次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

电压依赖性L-型钙通道广泛表达于多种细胞中,并发挥重要作用,包括基因转录、肌肉收缩、激素分泌、细胞分裂以及将电压信号转化为细胞内钙离子浓度的变化来介导信号转导过程等。但L-型钙通道的这些作用主要是在可兴奋性细胞中进行研究的,在非可兴奋性细胞如骨细胞中的研究还不够深入。肌动蛋白actin是细胞骨架蛋白的主要组成部分,它对L-型钙通道的调控作用也仅在可兴奋性细胞中有报道。很多在可兴奋性细胞中的研究表明肌动蛋白actin的聚合和解聚对L-型钙通道的功能都有调控作用。但由于actin在兴奋和非兴奋性细胞中的生理作用有较大区别,因此研究肌动蛋白actin对L-型钙通道在非兴奋细胞中的调控作用很有必要。在第一部分的研究中,我们通过全细胞膜片钳技术来观察肌动蛋白actin状态的改变对成骨细胞Ros17/2.8细胞中L-型钙通道电流的影响。实验结果表明12μM phalloidin可以显著增加钙电流,使钙电流峰电流密度从2.1pA/pF(n=27)增加到4.4pA/pF(n=23,P<0.05)。6μM cytochalasin D的处理非常显著地减低了钙电流幅度,钙电流峰电流密度从2.3pA/pF降低到1.3pA/pF(n=6, P<0.05)。在探讨其作用机制时我们运用细胞表面生物素化的方法检测actin解聚对L-型钙通道α1c亚基细胞膜上表达的影响。实验结果显示actin解聚并不影响alc亚基蛋白转在细胞膜上的表达量。有趣的是,cytochalasin D可导致钙电流失活曲线显著向负向移动。最大半数失活电压的降低具有剂量依赖性,分别从2.19+2.75mV(对照组)降低到-5.78+1.96 mV(1μM)、-14.35±1.72 mV(3μM)、-23.45±2.1 mV(6μM)(n=6,P<0.05)。但cytochalasin D对L-型钙通道激活时间常数没有明显影响。因此,我们推断在成骨细胞Ros 17/2.8中,肌动蛋白通过改变L-型钙通道动力学特征调节L-型钙通道的活性,而非通过改变α1c亚基的细胞表面表达量。cAMP对L-型钙通道功能有重要的调节作用,在第一部分中我们发现肌动蛋白actin状态可以显著影响L-型钙通道的功能,而cAMP可以影响actin重组,因此我们在第二部分的研究中探讨cAMP是否会通过actin信号途径来调节L-型钙通道的功能。通过免疫荧光的方法,我们发现应用不同剂量腺苷酸环化酶激活剂forskolin增加cAMP含量可以使细胞体积增大,伪足增多。免疫共沉淀实验结果显示肌动蛋白结合蛋白actinin4与L-型钙通道β3亚基之间有直接的相互作用,cAMP可以增强两者之间的相互作用,PKA阻滞剂H89不能完全阻断cAMP的作用,说明cAMP除了PKA途径外还有另外途径产生磷酸化作用。免疫双抗荧光标记结果更证实了actinin4与β3亚基之间的共定位关系。但actinin4与α1c之间却没有直接的相互作用,并且细胞表面生物素化实验结果同样显示cAMP对α1c细胞膜上表达无显著影响。上述结果表明：在成骨细胞Ros17/2.8中,cAMP可以通过影响肌动蛋白actin信号途径具体表现为结合蛋白actinin4与L-型钙通道的相互作用来调控L-型钙通道的功能。综上所述,我们的结论是：在成骨细胞中,肌动蛋白actin可以通过影响L-型钙通道的动力学特征以及肌动蛋白结合蛋白actinin4与L-型钙通道β3亚基之间的相互作用来调控L-型钙通道的功能。

全文目录

英文缩写  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
第一部分肌动蛋白actin对成骨细胞中L-型钙通道的作用及其作用机制  10-33
  引言  10-12
  材料和方法  12-20
    一、主要材料与试剂  12-14
      (一) 细胞培养主要试剂  12
      (二) 实验药物与试剂  12
      (三) 全细胞膜片钳记录钙电流主要试剂  12-14
    二、主要实验仪器和设备  14
    三、实验方法  14-20
      (一) 细胞培养  14
      (二) 全细胞膜片钳  14-15
      (三) 通道动力学研究  15
      (四) 表面生物素化  15-16
      (五) Western blot  16-19
      (六) 肌动蛋白张力丝的染色  19
      (七) 统计分析  19-20
  结果  20-27
    一、聚合肌动蛋白对成骨细胞Ros17/2.8中L-型钙通道电流的作用  20-21
    二、CD对成骨细胞Ros17/2.8中肌动蛋白的解聚作用  21-23
    三、肌动蛋白解聚对成骨细胞Ros17/2.8中L-型钙通道电流的作用  23-24
    四、肌动蛋白解聚对成骨细胞Ros17/2.8中α1c表面表达的影响  24-25
    五、CD对成骨细胞Ros 17/2.8中L-型钙通道动力学特征的剂量依赖性作用  25-27
  讨论  27-30
  参考文献  30-33
第二部分成骨细胞中cAMP诱导的actinin4和L-型钙通道β3亚基之间的相互作用  33-61
  引言  33-36
  材料与方法  36-40
    一、主要材料与试剂  36
      (一) 细胞培养主要试剂  36
      (二) 主要实验药物及试剂  36
    二、主要实验仪器和设备  36
    三、实验方法  36-40
      (一) 细胞培养  36-37
      (二) 肌动蛋白张力丝染色  37
      (三) 免疫双抗荧光标记  37
      (四) 免疫共沉淀  37-38
      (五) 表面生物素化  38
      (六) Western Blot  38
      (七) 转染  38-40
  结果  40-54
    一、随时间变化,cAMP对Ros17/2.8细胞形态及肌动蛋白actin的影响  40-41
    二、肌动蛋白结合蛋白actinin4与L-型钙通道β3亚基在成骨细胞Ros17/2.8中的表达  41-43
    三、cAMP对L-型钙通道亚基与肌动蛋白结合蛋白actinin4之间相互作用的影响  43-48
      (一) cAMP对L—型钙通道α1c亚基与肌动蛋白结合蛋白actinin4相互作用的影响  43-44
      (二) cAMP对L—型钙通道β3亚基与肌动蛋白结合蛋白actinin4相互作用的影响  44-46
      (三) H89对L—型钙通道β3亚基与肌动蛋白结合蛋白actinin4相互作用的影响  46-47
      (四) cAMP随时间延长对肌动蛋白结合蛋白actinin4与L-型钙通道β3亚基相互作用的影响  47-48
    四、cAMP对肌动蛋白结合蛋白actinin4与L-型钙通道β3亚基共定位的影响  48-51
    五、cAMP对L-型钙通道α1c亚基在细胞膜上表达的影响  51-54
  讨论  54-58
  参考文献  58-61
结论  61-62
研究方向  62-63
综述缝隙连接在骨重建中的作用及其与骨疾病的关系  63-75
  参考文献  72-75
致谢  75-76
论文发表  76-77

成骨细胞中肌动蛋白对cAMP调节的L-型钙通道的作用及其分子机制

内容摘要

全文目录

相似论文