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恶性疟原虫红前期融合抗原基因的合成及其在减毒伤寒杆菌中的诱导表达和免疫原性的测定

作　者: 杜景伶
导　师: 潘卫庆
学　校: 第二军医大学
专　业: 病原生物学
关键词: 恶性疟原虫融合蛋白 CSP TRAP 减毒伤寒杆菌基因表达兔疫原性
分类号: R382
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

血凝素相关匿名蛋白（thrombospondin related anonymous protein，TRAP）和环子孢子蛋白（Circumsporozoite protein，CSP）是两个重要的的红前期疟疾疫苗候选抗原，我们选取恶性疟原虫（Plasmodium.falciparum P.f）3D7株TRAP膜外区序列（氨基酸26～330）和CSP 19个4肽重复区及其羧基末端序列（氨基酸199～383），将这两个片段通过甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸（GPG）接点连接，产生了含有多个免疫功能域的恶性疟原虫融合蛋白4（PfCP-4），并人工全合成了pfcp-4基因。pfcp-4合成基因全长为1577bp，将该基因分成两个片段（pfcp-4a和pfcp-4b）分别合成。采用不对称PCR法将8条寡核苷酸链（长度分别为：120、116、126、125、113、115、118和105 bases）拼接成pfcp-4a DNA片段，再将另外8条链（长度分别为：117、105、132、138、115、119、118和96 bases）拼接为pfcp-4b DNA片段。两个片段分别克隆pBluescript载体进行测序和纠正错误序列。通过PstⅠ切点将两个序列正确的片段连接，产生全长pfcp-4合成基因。为检测该基因在异源系统中的表达，我们将全合成pfcp-4基因克隆在受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）调控的表达载体，再转化大肠杆菌SG13009进行诱导表达，并用抗CSP的免疫血清进行免疫印迹检测。结果显示，在IPTG诱导菌体中检测到约57KDa表达条带，该产物的大小与推算的分子量一致，而在未诱导和空载体菌样品中没检测到特异反应条带。这表明pfcp-4合成基因能在大肠杆菌中产生全长PfCP-4重组蛋白。本实验室已在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中建立了四环素诱导表达系统，并能在体内、外有效诱导表达外源基因，通过诱导表达可提高质粒在体内稳定性和表达水平。本研究目标之一是在该系统中诱导表达pfcp-4基因，并通过体内诱导表达检测小鼠产生的免疫应答反应。为此，将pfcp-4基因克隆在受去水四环素（aTc）调控的表达载体PZE11，并电转化入CVD908△aroC::tetR疫苗株进行诱导表达，体外结果显示，经aTc诱导后，该疫苗株能稳定产生57KDa全长目的蛋白，而在非诱导组未见表达条带，表明pfcp-4基因能在CVD908△aroC::tetR疫苗株中产生，并受aTc严格调控。将表达pfcp-4的伤寒杆菌疫苗株腹腔接种BALB/c小鼠，随后注射aTc进行体内诱导表达，共免疫3次。结果显示，在诱导组小鼠血清产生了明显抗PfCP-4 的特异抗体，而在未诱导组及空载体菌对照组小鼠血清中未检测到特异抗体，表明携带pfcp－4表达质粒的伤寒杆菌进入体内后，在aTe诱导下表达了PeP－4重组蛋白，并递呈给宿主兔疫系统产生应答反应。本研究通过基因合成，构建了由恶性疟原虫hhP和CSP组成的融合抗原基因，并能在人伤寒杆菌疫苗株中实现体内外诱导表达，兔疫小鼠产生了PfCP－4特异应答反应，这为进一步开展的减毒伤寒杆菌为传递载体的疟疾红前期疫苗的研制提供必要的基础。

全文目录

一．中文摘要  4-6
二．英文摘要  6-8
三．前言  8-11
四．论文正文  11-46
  （一）实验材料  11-19
  （二）实验方法  19-31
  （三）实验结果  31-43
  （四）讨论  43-46
五．参考文献  46-53
六．综述  53-67
七．致谢  67

恶性疟原虫红前期融合抗原基因的合成及其在减毒伤寒杆菌中的诱导表达和免疫原性的测定

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