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壳聚糖作载体的神经干细胞移植修复脑损伤研究

作　者: 衣昕
导　师: 金国华
学　校: 南通大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 壳聚糖多孔支架神经干细胞生物相容性分化神经元星形胶质细胞神经生长因子创伤性脑损伤移植 BDA追踪剂大鼠
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

第一部分壳聚糖支架制备及与神经干细胞生物相容性研究目的:初步研究壳聚糖(chitosan)多孔支架的制备,评价神经干细胞(neural stem cells, NSCs)与壳聚糖多孔支架的生物相容性并研究外源性神经生长因子(neuron growth factor, NGF)在壳聚糖多孔支架微环境中对NSCs分化的影响,探讨壳聚糖作为神经组织工程载体材料的可行性。方法:利用冷冻干燥技术制备壳聚糖多孔生物支架,采用乙醇替代法测定壳聚糖多孔支架孔隙率,形态分析系统软件测量支架孔径。从鼠胚前脑中分离NSCs并进行扩增,将传至第4代的亚细胞系NSCs接种于培养孔内已灭菌的壳聚糖多孔支架载体中继续体外培养,分为NSCs+支架+NGF组、NSCs+支架组。NSCs+支架+NGF组加入含100ng/ml NGF的DMEM/F12无血清培养基;NSCs+支架组加入DMEM/F12无血清培养基。2W后固定取材并行冰冻切片,行MAP-2、GFAP和CNP免疫组化染色,镜下观察,并进行MAP-2阳性细胞计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计分析。结果:冷冻干燥制备的壳聚糖多孔支架孔隙率为90%,多孔支架孔径为50~350μm。NSCs可以在壳聚糖多孔支架中存活、迁移并分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs+支架+NGF组MAP-2阳性细胞明显多于NSCs+支架组,且胞体较大,突起较多较长。结论:壳聚糖多孔支架与NSCs具有良好的生物相容性,外源性的NGF在壳聚糖多孔支架中能够促进NSCs向神经元分化,壳聚糖可以作为神经组织工程的备选支架材料。第二部分壳聚糖作载体的神经干细胞移植修复脑损伤研究目的:研究壳聚糖作载体的NSCs移植治疗对大鼠创伤性脑损伤的修复作用。方法:将从鼠胚前脑中分离的NSCs进行扩增,并标记BrdU。采用Feeney法致54只SD大鼠创伤性脑损伤,随机分为损伤对照组、NSCs+支架移植组、NSCs+支架+ NGF移植组,每组18只。损伤对照组:清创后不做移植;NSCs+支架移植组:清创后行壳聚糖作载体的NSCs移植;NSCS+支架+ NGF移植组:清创后行壳聚糖作载体的NSCs移植,并在壳聚糖载体中加入NGF。损伤对照组和两移植组大鼠于术后1个月、2个月、3个月三个时间点的前7d分别在损伤区和移植区注射BDA追踪剂,7d后3组大鼠应用避暗回避实验和跳台实验进行学习、记忆等认知功能检测,最后灌注取材、冰冻切片,行Nissl染色、GFAP免疫荧光染色以及BDA追踪组化染色,两移植组还行BrdU与NF-200、GFAP免疫荧光双标检测。结果:①术后1个月、2个月、3个月的行为学检测中两移植组的学习、记忆等认知功能较损伤对照组改善明显,而且NSCs+支架+ NGF移植组较NSCs+支架移植组的改善更加显著。②Nissl染色可见损伤对照组创伤区形成烧杯状空洞,损伤侧海马萎缩变形,两移植组创伤区有移植物填充,移植物中可见到许多尼氏细胞,术后3个月时移植物已经与宿主整合,壳聚糖支架部分降解,损伤侧海马萎缩不明显。③损伤对照组术后1个月创伤区周边可见到大量连接成网状的GFAP阳性细胞, GFAP阳性细胞荧光强度较强,术后3个月仍未有明显改变。两移植组术后1~3个月创伤区周边只见到少量的GFAP阳性细胞,GFAP阳性细胞荧光强度较弱,两移植组间无明显差异。④两移植组在术后1个月、2个月、3个月移植区均可见到BrdU与NF-200免疫荧光双标记阳性细胞,且NSCs+支架+ NGF移植组较NSCs+支架移植组阳性细胞数多、胞体大、突起多且长。术后3个月两移植组阳性细胞较前两个月在形态上更加成熟。⑤两移植组在术后1个月、2个月、3个月移植区均可见到较多的BrdU与GFAP免疫荧光双标记阳性细胞,两移植组间BrdU与GFAP双标细胞的数量和形态在术后1个月、2个月、3个月时均无明显差异。⑥损伤对照组术后1个月、2个月、3个月BDA追踪组化染色结果为阴性;两移植组在术后1个月、2个月未见到移植区内的细胞突起向宿主脑组织区延伸,术后3个月时移植区内的细胞突起已经延伸至宿主脑组织区,而且NSCs+支架+NGF移植组向宿主脑组织延伸的突起较NSCs+支架移植组多。结论:大鼠创伤性脑损伤后进行壳聚糖作载体的NSCs移植治疗,可以改善大鼠的学习、记忆等认知功能;移植物可以减轻损伤侧海马萎缩变形,并且抑制创伤区周边的胶质细胞增生反应;移植的NSCs可以在脑损伤区的壳聚糖支架中存活、迁移并分化为神经元和星形胶质细胞;外源性的NGF可以促进移植的NSCs向神经元分化,及与宿主脑组织建立联系,更好地改善脑损伤大鼠的认知功能。

全文目录

英文缩写词表  3-4
中文摘要  4-7
英文摘要  7-12
前言  12-15
第一部分  15-26
  材料与方法  15-19
  结果  19-23
  讨论  23-26
第二部分  26-51
  材料与方法  26-36
  结果  36-47
  讨论  47-51
结论  51-52
参考文献  52-59
综述  59-89
致谢  89-90
已发表文章  90
在读期间所获奖励  90

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