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ipt基因表达载体的构建及其水稻遗传转化研究

作　者: 钱秋芳
导　师: 王贵学；蔡平钟
学　校: 重庆大学
专　业: 植物学
关键词: ipt基因 PSAG12启动子克隆农杆菌遗传转化水稻
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

植物叶片衰老是叶片发育的最后阶段。叶片衰老过程有着很重要的实际价值,因为当叶片衰老进行时,植物的营养成分可以转运到植物其它的生长部位,使营养物质得以再利用。然而在农业生产上,叶片衰老会带来不利影响,它将极大地限制作物产量潜力的发挥。水稻生育后期叶片过早衰老,导致同化能力降低,制约着水稻产量的进一步提高,细胞分裂素是一种重要的延缓植物叶片衰老进程的植物激素,ipt基因是细胞分裂素生物合成的关键酶基因,将叶片衰老特异表达的启动子PSAG12与ipt基因融合构成嵌合基因后再导入水稻中,可以特异性地提高转基因水稻体内的细胞分裂素水平,从而有效地延缓水稻叶片的衰老,为提高水稻的产量探索一条新的途径。本研究克隆了ipt基因及启动子PSAG12,并构建了适合水稻转化的表达载体,通过农杆菌介导法将其导入水稻并进行相应的分子检测,主要研究结果如下:1.以根癌土壤农杆菌C58 Ti质粒为模板,采取PCR方法,克隆了ipt基因,序列测定结果表明,插入片段全长723bp,包含了该基因完整的编码阅读框,与发表的ipt基因核苷酸同源性为100%(AE009419)。2.根据已知的PSAG12启动子序列设计引物,成功从拟南芥基因组中克隆SAG12基因5’侧翼1522bp启动子区域,与GenBank上公布的SAG12基因(ATU37336)的上游序列有99%的核苷酸序列同源性。3.通过一系列的酶切、电泳、目的片断的回收过程,将ipt基因和PSAG12启动子克隆到双元表达载体pCAMBIA1301上,构建出pCAMBIA1301-SAG12-ipt表达载体。4.通过冻融法将植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105,PCR筛选出阳性克隆,获得含有目的基因的工程菌。以水稻品种中花16和浙大H02-117的胚性愈伤为材料,进行农杆菌介导的遗传转化,通过潮霉素筛选,共获得37株抗性植株,经过PCR初步检测,4株为阳性植株,其中水稻品种中花16和浙大H02-117各2株。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
1 绪论  11-26
  1.1 植物叶片衰老  11
  1.2 植物叶片衰老的特征和机理  11
  1.3 影响植物叶片衰老的因素  11-13
    1.3.1 外部因素  11-12
    1.3.2 内部因素  12-13
  1.4 叶片衰老与作物产量  13-14
  1.5 细胞分裂素合成基因 ipt 及其基因工程研究进展  14-20
    1.5.1 细胞分裂素的生物功能  14-15
    1.5.2 异戊烯基转移酶( IPT）简介  15
    1.5.3 转异戊烯基转移酶基因的研究进展  15-20
  1.6 水稻转基因方法的研究进展  20-23
    1.6.1 花粉管通道法  20
    1.6.2 基因枪法  20-21
    1.6.3 PEG 法  21
    1.6.4 电激法  21
    1.6.5 农杆菌介导法  21-23
  1.7 研究的目的意义及技术路线  23-26
    1.7.1 研究的目的和意义  23-24
    1.7.2 主要研究内容及技术路线  24-26
2 基因克隆及植物表达载体的构建  26-44
  2.1 材料与试剂  26-28
    2.1.1 供试材料、质粒、菌株、试剂  26
    2.1.2 主要仪器设备  26
    2.1.3 常用试剂配制  26-28
  2.2 实验方法  28-30
    2.2.1 根癌农杆菌C58 Ti 质粒DNA 提取  28
    2.2.2 拟南芥叶片基因组DNA 小量提取（修改的CTAB 法）  28-29
    2.2.3 小量碱裂解法提取质粒  29
    2.2.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备（TaKaRa Competent Cell Preparation Kit）  29-30
    2.2.5 核酸的电泳及纯度、浓度测定  30
    2.2.6 菌种保存  30
  2.3 ipt 基因和 SAG12 启动子的克隆  30-33
    2.3.1 ipt 基因的克隆  30-31
    2.3.2 SAG12 基因启动子的克隆  31-32
    2.3.3 DNA 片段快速回收（试剂盒采用OMEGA 公司产品）  32
    2.3.4 DNA 连接  32
    2.3.5 质粒DNA 的转化  32-33
    2.3.6 重组质粒的PCR 和酶切鉴定  33
    2.3.7 序列测定  33
  2.4 植物双元表达载体的构建  33-34
    2.4.1 pCAMBIA1301-ipt 中间载体的构建  33
    2.4.2 pCAMBIA1301-SAG12-ipt 植物表达载体的构建  33-34
  2.5 根癌农杆菌的转化  34-35
    2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备及转化  34-35
    2.5.2 农杆菌的PCR 鉴定  35
  2.6 结果与分析  35-42
    2.6.1 ipt 基因的扩增、克隆和测序  35-37
    2.6.2 启动子的PCR 扩增、克隆和测序  37-39
    2.6.3 pCAMBIA1301-ipt 载体的构建  39
    2.6.4 pCAMBIA1301-SAG12-ipt 植物表达载体的构建  39-42
  2.7 讨论  42-44
    2.7.1 根癌农杆菌Ti 质粒的提取  42
    2.7.2 基因和启动子的克隆  42
    2.7.3 表达载体的构建  42-44
3 水稻遗传转化体系的建立  44-47
  3.1 材料与试剂设备  44
    3.1.1 生物材料  44
    3.1.2 主要仪器设备  44
    3.1.3 培养基  44
  3.2 实验方法  44-45
    3.2.1 水稻愈伤组织的诱导  44
    3.2.2 植株再生  44-45
  3.3 结果与分析  45
    3.3.1 愈伤组织的诱导  45
    3.3.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响  45
  3.4 讨论  45-47
    3.4.1 培养基对愈伤组织的影响  45-46
    3.4.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响  46-47
4 农杆菌介导法转化水稻  47-54
  4.1 材料与试剂设备  47
    4.1.1 供试材料、试剂  47
    4.1.2 主要仪器设备  47
    4.1.3 培养基  47
  4.2 实验方法  47-49
    4.2.1 农杆菌的培养  47-48
    4.2.2 共培养  48
    4.2.3 洗菌与选择  48
    4.2.4 分化与生根  48
    4.2.5 潮霉素本底抗性测定  48
    4.2.6 转基因植株的分子检测  48-49
  4.3 结果与分析  49-52
    4.3.1 水稻胚性愈伤组织的获得  49-50
    4.3.2 潮霉素本底抗性的测定  50
    4.3.3 转基因水稻植株的获得  50-51
    4.3.4 转基因植株的PCR 检测  51-52
  4.4 讨论  52-54
    4.4.1 转化受体  52
    4.4.2 共培养时间对于转化的影响  52
    4.4.3 选择标记  52-54
5 结论与展望  54-55
  5.1 主要结论  54
  5.2 后续研究工作展望  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-63
附录  63-67
  附件一：NB 培养基  64-65
  附件二：N6 培养基  65-67

ipt基因表达载体的构建及其水稻遗传转化研究

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