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人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的克隆研究

作　者: 赵颖煊
导　师: 赵守亮；唐荣银；吕海鹏
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 人成牙本质细胞细胞分离钙离子通道基因克隆牙齿
分类号: R78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

牙本质是构成牙齿的主体，在生理情况下只有矿化过程，不存在类似于骨组织的吸收和改建过程，牙本质的形成细胞——成牙本质细胞具有终身形成牙本质的能力，也是牙本质发生损伤，龋损时的修复细胞。因此，以成牙本质细胞为研究对象，可以直观的反映牙本质的形成和修复机制，并在一定程度上可以反映人类矿化细胞在组织矿化过程中的作用机制。成牙本质细胞是位于牙髓组织外周的高柱状细胞，来源于外胚间充质细胞，在牙本质矿化过程中起重要的作用。研究表明，许多分子参与了牙本质矿化的过程，目前已知有L型钙离子通道、钙离子ATP酶、钠钙离子交换泵和钙结合蛋白等，其中L型钙离子通道起着主要作用。L型钙离子通道是由α1、α2、β、γ、δ五种亚基构成的高分子糖蛋白复合体，α1亚基是L型钙离子通道主要的功能单位，可独立表达出具有功能活性的钙离子通道，α1亚基有α1C、α1D、α1S三种基因型。研究发现在小鼠成牙本质细胞膜上L型钙离子通道α1亚基D亚型的表达较高，它可能在牙本质矿化过程中对钙离子的转运起主要作用。课题组曾利用永生化成牙本质细胞系进行了人成牙本质样细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因片段克隆研究，而国外对人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基的基因水平的研究还未见报道。成牙本质细胞与牙本质紧密相连，细胞呈单层排列于牙髓组织的表面，在牙髓中主要为其胞体结构，有胞浆突起伸入牙本质小管中，并且细胞数量较少，加之成牙本质细胞是一种高度分化的终末细胞，无论在体内还是体外正常培养环境中都不可能继续分化、增殖，因此采用常规方法难以获得大量纯化的成牙本质细胞。课题组采用联合酶消化法直接由新鲜离体牙中成功的分离出成牙本质细胞。直接由离体牙分离的成牙本质细胞保留了原有细胞的特性，因此是比较理想的研究成牙本质细胞性能的细胞来源，把它作为研究对象，将更具有科学性。本研究采用联合酶消化法从新鲜人离体牙中分离出完整的人成牙本质细胞，由细胞中克隆出L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因片段，并对其进行测序鉴定，经与已登录的人L型钙离子通道α1亚基D亚型基因序列比对，证实克隆出的基因片段为人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型的特异性基因片段；随后构建了该特异性基因的原核表达载体，将重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，表达出人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性蛋白。本研究为进一步了解人成牙本质细胞的钙离子转运机制奠定了基础。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-13
文献回顾  13-27
正文  27-73
  实验一人成牙本质细胞的分离和提取  27-32
    1 材料  27-28
    2 方法  28-30
    3 结果  30
    4 讨论  30-32
  实验二人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的克隆  32-45
    1 材料和仪器  32-34
    2 实验方法  34-39
    3 结果  39-44
    4 讨论  44-45
  实验三人成牙本质细胞L型钙离子通道α _1亚基D亚型特异性基因原核表达质粒的构建  45-51
    1 材料和仪器  45-47
    2 实验方法  47-48
    3 结果  48-49
    4 讨论  49-51
   实验四人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性蛋白的表达和纯化  51-59
    1 材料和仪器  51
    2 实验方法  51-55
    3 结果  55-56
    4 讨论  56-59
  小结  59-60
  参考文献  60-73
附图  73-75
临床病例  75-91
个人简历和研究成果  91-92
致谢  92

人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的克隆研究

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