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ε-聚赖氨酸的菌种选育及合成过程强化

作　者: 廖莉娟
导　师: 毛忠贵
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: ε-聚赖氨酸菌种筛选氨基酸原生质体育种
分类号: TQ922.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合的酰胺键聚合而成。它具有水溶性强、热稳定性好、抑菌谱广、无毒可食用等化学防腐剂无法比拟的优点,因此是一种安全高效的天然生物防腐剂。另外,由于ε-PL支链带有正电荷的α-NH2,它还能用作生物可降解材料、乳化剂、高吸收性水凝胶、药物载体、抗癌增进剂和生物芯片外被等,所以有着广阔的发展前景。本论文主要对以下几个部分进行了研究：对已有的ε-PL产生菌的筛选方法进行了改进。首次报道了一种对菌体毒性远小于美蓝的染色剂—诱惑红,直接添加到初筛培养基平板中,完全不影响菌体的生长。诱惑红作为一种阴离子型染料能与带正电荷的ε-PL发生静电吸引而形成浓缩的颜色圈,从而简化了筛菌步骤,可以快速、方便的筛选出目的菌。利用该方法,成功地从土壤中筛选得到了26株ε-PL产生菌,产量为0.15-0.50g/L；通过薄板层析,进一步确定了菌株的产物是赖氨酸聚合物。探索了对禾粟链霉菌(Streptomyces graminearus)进行原生质体融合育种的方法。首先对禾粟链霉菌原生质体制备与融合的主要因素进行了研究,最佳条件为：0.5%(W/V)溶菌酶作为破壁酶,30℃酶解120 min,得到原生质体后采用30%(W/V)的PEG 6000促融5 min。以磺胺胍抗性为指标,筛选紫外诱变后的禾粟链霉菌作为融合亲本,按上述条件进行原生质体融合,得到了最高产量为0.91 g/L的融合子,较初始菌株的产量提高了72%。考察了不同氨基酸对禾粟链霉菌发酵生产ε-PL的影响。发现在添加浓度为1 mM时,苯丙氨酸(Phe)对ε-PL发酵的促进作用最明显,进一步对Phe的添加浓度和添加时间进行了优化,在发酵初始添加3 mM Phe使ε-PL产量提高了20-30%。首次建立了禾粟链霉菌以葡萄糖为碳源发酵生产ε-PL的中心代谢网络,并通过代谢流量分析(MFA)阐述了Phe促进ε-PL产量提高的内在机理,即添加Phe抑制了莽草酸途径中的关键酶,阻碍莽草酸途径,使PEP更多的流向了OAA,最终使ε-PL产量提高。研究还表明,在发酵48 h时添加1.37 g/L赖氨酸(Lys),可使产量提高64.8%,说明存在着外源Lys直接转化为ε-PL的可能性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-7
第一章绪论  7-15
  1.1 食品防腐剂  7-8
  1.2 微生物源生物防腐剂  8-12
    1.2.1 钠他霉素  8
    1.2.2 乳酸链球菌素  8-9
    1.2.3 ε-聚赖氨酸  9-12
  1.3 本论文研究的目的和内容  12-15
第二章材料与方法  15-23
  2.1 实验材料  15-18
    2.1.1 实验试剂  15-16
    2.1.2 实验仪器  16
    2.1.3 相关溶液配制  16-17
    2.1.4 培养基  17
    2.1.5 土样的采集  17-18
  2.2 实验方法  18-21
    2.2.1 不同碱性染料形成透明圈效果的比较  18
    2.2.2 不同染料对产生菌毒性大小的比较  18
    2.2.3 诱惑红最佳使用浓度的确定  18
    2.2.4 ε-PL浓度与颜色圈大小的关系  18
    2.2.5 菌株产量与颜色圈大小的关系  18-19
    2.2.6 目的菌株的筛选步骤  19
    2.2.7 摇瓶发酵培养条件  19
    2.2.8 氨基酸添加方式  19
    2.2.9 原生质体融合亲本的获得  19
    2.2.10 原生质体制备步骤  19-20
    2.2.11 溶菌酶浓度对原生质体制备的影响  20
    2.2.12 酶解时间对原生质体制备的影响  20
    2.2.13 酶解温度对原生质体制备的影响  20
    2.2.14 原生质体灭活  20
    2.2.15 原生质体融合  20
    2.2.16 PEG 6000浓度对原生质体融合的影响  20-21
  2.3 分析方法  21-23
    2.3.1 菌体量测量  21
    2.3.2 残糖测定  21
    2.3.3 pH测定  21
    2.3.4 ε-PL含量测定  21
    2.3.5 氨基酸含量测定—OPA FMOC柱前衍生法  21
    2.3.6 赖氨酸含量检测  21
    2.3.7 原生质体制备率、再生率、融合率的计算  21-23
第三章结果与讨论  23-43
  3.1 ε-聚赖氨酸生产菌的筛选  23-29
    3.1.1 筛菌方法的改进  23-27
    3.1.2 利用诱惑红颜色圈法筛选ε-PL产生菌  27-29
  3.2 原生质体融合育种  29-32
    3.2.1 溶菌酶浓度对原生质体制备的影响  29-30
    3.2.2 溶菌酶酶解时间对原生质体制备的影响  30
    3.2.3 酶解温度对原生质体制备的影响  30-31
    3.2.4 聚乙二醇(PEG 6000)浓度对原生质体融合的影响  31-32
    3.2.5 高产融合子的筛选  32
  3.3 氨基酸对E-聚赖氨酸发酵的影响  32-43
    3.3.1 不同氨基酸对禾粟链霉菌合成ε-PL的影响  33
    3.3.2 苯丙氨酸(Phe)对ε-PL发酵的影响  33-35
    3.3.3 探索Phe促进ε-PL合成的的原因—代谢流量分析  35-40
    3.3.4 外源赖氨酸对ε-聚赖氨酸发酵的影响  40-43
第四章主要结论与展望  43-45
  4.1 主要结论  43
  4.2 展望  43-45
致谢  45-47
参考文献  47-51
附录一:缩略语表  51-53
附录二:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  53

ε-聚赖氨酸的菌种选育及合成过程强化

内容摘要

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