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应用生物功能化纳米颗粒检测大肠杆菌O157：H7的研究

作　者: 蒲小平
导　师: 杨海麟
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 磁性纳米颗粒金纳米颗粒生物条形码 PCR DNA探针大肠杆菌O157:H7
分类号: R155
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大肠杆菌O157：H7(Escherichia coli O157:H7, E. coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型,曾在世界范围内多次暴发,严重威胁着人们的健康并造成巨大经济损失。本文建立了两种生物功能化纳米颗粒对大肠杆菌0157：H7进行检测的方法,并用于对人工污染牛奶样品的检测,主要研究方面如下：生物功能化纳米颗粒的制备。利用柠檬酸钠还原法制备粒径为13 nm的金纳米颗粒(Au-NPs),用大肠杆菌O157：H7多克隆抗体、巯基化捕获DNA链、条形码DNA链、探针DNA链等制备生物功能化Au-NPs,利用UV-vis、TEM等对制备和修饰过程进行表征。通过共沉淀法制备粒径为27±4 nm的磁性纳米颗粒(MNPs),采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰和戊二醛交联制备得到大肠杆菌0157：H7单克隆抗体功能化的MNPs。生物功能化纳米颗粒检测大肠杆菌0157：H7方法研究。利用生物功能化的MNPs和Au-NPs与目标物大肠杆菌0157：H7进行免疫反应,形成MNPs/目标物/Au-NPs "三明治”式复合体,磁场分离后去杂交将Au-NPs上标记的条形码DNA释放出,通过PCR扩增和电泳对大肠杆菌0157：H7进行定量分析,建立了基于生物条形码的常规PCR的检测方法。该方法对标准样品的最低检测限为10CFU/mL,检测范围为10-106CFU/mL;与大肠杆菌其他血清型和常见食源性病原菌如大肠杆菌086：H2、大肠杆菌0111：K58,大肠杆菌K12,沙门氏菌均不发生交叉反应,特异性好；方法的重复性较好,批内重复性平均变异系数为(6.6±3.3)%,批间重复性平均变异系数为(7.3±3.6)%。在前一种方法的基础上,将Au-NPs上标记的条形码DNA释放出,利用DNA探针杂交条形码DNA引起Au-NPs颜色变化建立基于生物条形码探针和Au-NPs的检测方法,结果表明,对标准样品最低检测限可达到102CFU/mL,该方法具有良好的特异性；而在重复性实验中,批内及批间重复性平均变异系数分别为(2.9±1.3)%和(3.2±1.5)%。大肠杆菌O157：H7人工污染牛奶样品检测研究。应用基于生物条形码的常规PCR对人工污染大肠杆菌O157：H7牛奶样品检测的最低检测限为10CFU/mL;基于生物条形码探针和Au-NPs的检测方法对样品实测的最低检测限为102CFU/mL,并比较了两种检测方法。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
第一章引言  7-15
  1.1 传统的检测方法  7
  1.2 免疫学检测方法  7-9
    1.2.1 酶免疫测定技术  7-8
    1.2.2 免疫层析技术  8
    1.2.3 免疫磁珠分离技术  8-9
  1.3 分子生物学检测方法  9-10
  1.4 纳米技术及其在生物分析中的应用  10-14
    1.4.1 纳米材料概述  10
    1.4.2 纳米技术在生物分析中的应用  10-14
  1.5 立题背景及本文的主要研究内容  14-15
第二章材料与方法  15-23
  2.1 材料  15-16
    2.1.1 实验用微生物  15
    2.1.2 培养基  15
    2.1.3 化学试剂  15
    2.1.4 生化试剂  15-16
    2.1.5 主要仪器和设备  16
    2.1.6 主要溶液的配制  16
  2.2 方法  16-23
    2.2.1 抗体和寡核苷酸双修饰金纳米颗粒的制备  16-18
    2.2.2 探针修饰金纳米颗粒的制备  18
    2.2.3 生物功能化的磁性纳米颗粒制备  18-19
    2.2.4 食源性病原微生物的制备  19
    2.2.5 基于生物条形码的常规PCR检测方法的建立  19-20
    2.2.6 基于生物条形码探针和金纳米颗粒检测方法的建立  20-21
    2.2.7 对人工污染牛奶中的大肠杆菌O157:H7的实测  21-23
第三章结果与讨论  23-41
  3.1 生物功能化金纳米颗粒和磁性纳米颗粒的制备和鉴定  23-28
    3.1.1 金纳米颗粒的鉴定结果  23-24
    3.1.2 抗体和DNA双修饰金纳米颗粒的制备及鉴定结果  24-26
    3.1.3 探针修饰的金纳米颗粒的鉴定结果  26-27
    3.1.4 生物功能化磁性纳米颗粒表面抗体偶联效率测定  27-28
  3.2 生物功能化纳米颗粒检测大肠杆菌O157:H7方法研究  28-36
    3.2.1 基于生物条形码的常规PCR检测大肠杆菌O157:H7  28-32
    3.2.2 基于生物条形码和金纳米颗粒检测大肠杆菌O157:H7  32-36
  3.3 对人工污染牛奶中大肠杆菌O157:H7检测结果  36-41
    3.3.1 基于生物条形码的常规PCR对人工污染牛奶检测结果  36-37
    3.3.2 基于生物条形码和金纳米颗粒对人工污染牛奶检测结果  37-41
结论  41-43
致谢  43-45
参考文献  45-51
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  51

应用生物功能化纳米颗粒检测大肠杆菌O157：H7的研究

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