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脑缺血性卒中(ischemic stroke,IS)在世界范围内均有很高的发病率、死亡率及神经致残率。随着老龄化社会的到来,IS发病率正逐步增加,对人类健康的危害还在进一步加大。尽管借助现有的CT、MRI等影像学技术,可以检查出多数IS,但在疾病早期甚至有些情况下,能够及时做出诊断仍有困难。而发现与脑缺血性损伤相关的特异性和敏感性分子标志,有助于建立新的早期分子诊断方法。2006年6月,华盛顿大学Ladenson研究小组报道,采用基因阵列技术、生物信息学分析初筛结合Western blot进一步印证的策略,筛选出脑高丰度、高特异表达的蛋白:视锥蛋白样蛋白-1(visinin-like protein 1,VILIP-1);并且在IS患者和动物模型体内,他们亦检测到VILIP-1表达上调。因此,VILIP-1有望成为缺血性脑损伤重要的分子标志。Vsnl1是VILIP-1蛋白的编码基因,其cDNA全长576 bp。GenBank数据库资料显示,在人类、小鼠和大鼠,vsnl1序列基本相同,并且在基底节、前脑、小脑和大脑等脑组织和绝大多数的脑神经细胞均有高丰度表达。VILIP-1隶属神经钙传感蛋白(NCS)家族中VILIP亚家族成员,其在健康脑组织的组成性表达特征已获初步阐明,但作为一个与IS密切相关的重要分子,在相关动物模型乃至IS患者的表达特性仍不清楚。本研究对vsnl1进行了克隆和原核表达,并建立了线栓法IS大鼠模型,进一步对vsnl1基因的转录水平变化进行了研究。一、Vsnl1基因的克隆与原核表达首先,通过PrimerSelect软件优化设计引物序列。然后,取健康BALB/c小鼠全脑,用BIOZOL试剂进行总RNA提取和纯化。以RNase-free DNaseⅠ消化去除残存DNA后,行逆转录反应获得cDNA,并以后者为模板行PCR反应扩增vsnl1。将PCR目的片段连接至pMD18-T,经酶切和测序鉴定后,将序列提交GenBank,并行BLAST比对、分析。经亚克隆技术,构建含6xHis标签的原核表达质粒pROEX-v,转化宿主菌DH5a,行IPTG诱导表达及Ni-NTA柱纯化。结果表明:(1)通过两步法RT-PCR,扩增产物为576 bp,和vsnl1基因预期大小一致;(2)经序列测定及BLAST比对分析,提示存在nt205(T-C)和nt314(T-A)两个突变位点,与已公布的vsnl1同源性为99%,基因序列已提交GenBank,获登录号为EU373446;(3)成功构建pROEX-v,诱导表达产物经SDS-PAGE证实,在约22 kDa处有目的蛋白条带,与预期分子量大小一致;(4)对Ni-NTA柱纯化样品行SDS-PAGE分析,结果同样显示,在约22 kDa处出现纯化的目的蛋白条带,但得率略低。二、缺血性脑卒中大鼠模型的制备及vsnl1的转录研究首先,参考文献报道的线栓法制模方法,建立大鼠右侧大脑中动脉阻塞(middlecerebral arterial occlusion,MCAO)模型,永久性(pMCAO)和短暂性(tMCAO)阻塞模型动物各11只,10只未行MCA阻塞的大鼠为对照。对动物进行神经病学评分,并对脑切片进行组织病理学鉴定。其次,心脏灌注后取脑,提取各组脑标本的梗塞(右)侧和未梗塞(左)侧总RNA,彻底消化去除残留DNA后逆转录获得cDNA。再次,行半定量PCR,并用Quantity One软件行灰度扫描,将vsnl1对于β-actin的光密度积分比值作为半定量指标,进行比较分析。最后,通过DNAMAN、PrimerSelect软件优化设计荧光定量PCR引物,采用荧光定量PCR方法,以各组脑标本的梗塞侧和未梗塞侧cDNA为模板,进一步对vsnl1转录水平行定量检测分析。结果表明:(1)神经病学评分显示,梗塞术后24 h,MCAO大鼠均表现出显著的神经功能缺损症状(pMCAO,2.64±1.03;tMCAO,2.27±0.90;对照,0),pMCAO和tMCAO组与对照组间均存在统计学差异(P＜0.05),而pMCAO和tMCAO组间无明显差异(P＞0.05)。结果还提示,tMCAO组大鼠较pMCAO组似乎有更长的生存时间,提示早期再灌注有益于延长IS摸型生存时间。(2)TTC染色显示,在pMCAO和tMCAO大鼠模型脑组织的右侧MCA供血区,包括大脑皮层、纹状体和海马等部位,均可见明显的梗塞灶;而正常大鼠及MCAO大鼠的左侧大脑为均匀红染区域、无梗塞灶。HE染色镜下结果显示,MCAO大鼠的梗塞侧脑组织有较多的梗塞灶和微梗塞灶,同时,还可见细胞水肿、变性、坏死等病理学变化,而对照正常。尚发现,pMCAO鼠较tMCAO梗塞病灶更为严重,表现为梗塞面积大和病灶数量多。(3)半定量PCR结果显示,在对照组,左右两侧脑组织vsnl1转录水平相似。而在pMCAO和tMCAO组,缺血侧脑组织vsnl1转录水平低于非缺血侧。(4)荧光定量PCR显示,vsnl1的相对转录水平(vsnl1 mRNA/β-actin mRNA),在pMCAO非缺血侧为0.040±0.007,缺血侧为0.023±0.002;在tMCAO非缺血侧为0.049±0.011,缺血侧为0.030±0.002。提示,缺血侧vsnl1转录水平低于非缺血侧,尽管无显著统计学意义。在对照组,左右两侧的vsnl1转录水平基本相同。我们推测,钙稳态失衡可能是MCAO脑组织vsnl1转录下调的重要机制之一。但,鉴于VILIP-1具有的前凋亡作用及多种信号级联调控功能等复杂角色,详细的机制仍有待将来进一步研究证实。
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