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水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的功能分析

作　者: 丁林云
导　师: 张红生
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 原核表达 酶活性 亚细胞定位 转基因烟草
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


磷酸戊糖途径（Pentose phosphate pathway,PPP）与植物的生长发育及多种胁迫应答相关,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH,EC1.1.1.44）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phophate dehydrogenase,G6PDHEC1.1.1.49）是PPP途径的两个关键酶。植物细胞中的6PGDH与G6PDH均可分成胞质与质体两种类型。6PGDH酶催化PPP途径的第三步反应,将6-磷酸葡萄糖酸脱氢后生成5-磷酸核酮糖CO2,同时伴随NADP+的还原,此反应是不可逆的。本实验室研究表明,水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Os6PGDH1在水稻幼苗中的表达受高盐、低温、干旱和ABA等不同程度诱导,在非生物胁迫下水稻幼苗中6PGDH的酶活性显著增强,Os6PGDH1可能参与并调节水稻对非生物胁迫的应答。为了研究Os6PGDH1基因的功能,以已公布的Os6PGDH1（GenBank注册号:AF486280）cDNA序列为探针,利用BLAST软件搜索水稻基因组数据库,设计引物,经RT-PCR克隆获得了Os6PGDH1基因的完整ORF。构建原核表达载体pET30（+）-Os6PGDH1,转化大肠杆菌BL21细胞,通过IPTG诱导外源基因表达,并测定了重组细菌总蛋白的相对酶活性,证明编码融合蛋白的重组质粒（pET30a（+）-Os6PGDH1）细菌在经过IPTG诱导表达后,细菌总蛋白的相对酶活性比含有空载体pET30a（+）细菌的相对酶活性高40.06%,初步证明Os6PGDH1基因是一个编码6PGDH的功能基因。构建了瞬时表达载体pBI121-Os6PGDH1-GUS,采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明Os6PGDH1定位于洋葱表皮细胞的胞质中。构建植物表达载体pBI121-Os6PGDH1,通过农杆菌介导叶盘转化法将Os6PGDH1转化到野生型烟草,经卡那霉素抗性筛选、PCR和RT-PCR检测,获得了转Os6PGDH1基因植株,转基因植株（T0）的6PGDH酶活性和对盐胁迫的耐受性均有一定提高。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
符号及缩略语  9-11
第一部分 文献综述  11-27
  第一章 糖代谢途径的有关调节机制  11-17
    第一节 呼吸代谢途径  11-14
      1 呼吸代谢的调节机制  12-13
      2 植物呼吸代谢与胁迫应答  13-14
    第二节 分解代谢途径  14-17
      1 糖酵解途径  14
      2 三羧酸循环途径  14-15
      3 磷酸戊糖途径  15-17
  第二章 戊糖磷酸途径与逆境应答的研究进展  17-27
    第一节 磷酸戊糖途径  17-21
      1 磷酸戊糖途径的生物学功能  17-18
      2 戊糖磷酸途中两个关键酶  18-21
    第二节 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的研究进展  21-27
      1 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)基因的结构  21-22
      2 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)的限速途径  22-23
      3 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)的功能研究  23-24
      4 研究展望  24-27
第二部分 研究报告  27-59
  第三章 水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的功能分析  27-59
    1.试验材料与方法  27-43
      1.1 植物材料及种植  27-28
      1.2 菌株和质粒  28
      1.3 主要缓冲液、试剂及抗生素  28-29
      1.4 培养基  29-30
      1.5 PCR引物  30
      1.6 PCR产物的扩增  30-31
      1.7 PCR产物的回收与连接  31
      1.8 目的片段的转化及阳性克隆的鉴定  31-32
      1.9 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞(JM109)  32
      1.10 质粒DNA的抽提  32-33
      1.11 农杆菌EHA105感受态细胞的制备  33
      1.12 质粒转化农杆菌EHA105细胞  33-34
      1.13 pBI121-Os6PGDH1植物转化载体的构建  34
      1.14 pBI121-Os6PGDH1-GUS瞬时表达载体的构建  34-35
      1.15 pET30a(+)-Os6PGDH1原核表达载体的构建  35
      1.16 Os6PGDH1启动子克隆及在转基因烟草中的活性分析  35-36
      1.17 序列测定  36
      1.18 pBI121-Os6PGDH1-GUS洋葱表皮细胞的转化  36
      1.19 pET-30a(+)-Os6PGDH1融合蛋白的诱导表达  36-37
      1.20 Os6PGDH1融合蛋白酶活性测定  37
      1.21 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草  37-38
      1.22 转基因烟草检测  38-39
      1.23 转基因烟草阳性植株的RT-PCR分析  39-40
      1.24 转基因烟草T_0代组织酶活性分析  40-41
      1.25 T_0代转基因烟草的耐逆性评价  41-42
      1.26 生物信息学分析  42-43
    2.结果与分析  43-54
      2.1 Os6PGDH1的亚细胞定位  43-44
      2.2 Os6PGDH1基因的原核表达  44-45
      2.3 Os6PGDH1基因融合蛋白酶活性测定  45-47
      2.4 Os6PGDH1转化烟草  47
      2.5 Os6PGDH1转基因烟草的检测  47-50
      2.6 T_0代转Os6PGDH1基因烟草酶活性测定  50-51
      2.7 Os6PGDH1转基因烟草的农艺性状和耐盐性  51
      2.8 Os6PGDH1基因启动子区域的克隆  51-54
    3.讨论  54-59
      3.1 水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的原核表达及酶活性测定  54-55
      3.2 水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的亚细胞定位  55-56
      3.3 水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因转化烟草  56-57
      3.4 水稻胞质6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因启动子的研究  57-59
全文结论  59-61
参考文献  61-69
攻读硕士学位期间发表的论文  69-71
附录  71-79
致谢  79

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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