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高羊茅中AtNYE1、AtNAP同源基因的分离及功能分析

作　者: 郭玉娟
导　师: 蒯本科
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 叶绿素降解 衰老 FaNYE1 FaNAP 克隆 RACE 高羊茅
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 21次
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内容摘要


AtNYE1是拟南芥叶绿素降解过程中的一个重要调控基因。本实验利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,在高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)中分离了一个AtNYE1的同源基因FaNYE1,并对其进行了功能分析。FaNYE1 cDNA全长1441bp,包含834bp长的开放阅读框(open reading frame),编码一个含有278个氨基酸残基的多肽,其基因组含有2个内含子,3个外显子。序列分析显示,FaNYE1与大麦中的NYE1相似性最高,而与AtNYE1具有62%的相似性。对FaNYE1的表达模式分析显示,衰老和黑暗均能显著诱导FaNYE1的表达。FaNYE1在拟南芥中的功能分析表明,FaNYE1能够异源互补拟南芥nyel-1突变体的滞绿表型,且互补表型与FaNYE1的表达量成正相关,组成型过表达FaNYE1能够明显促进叶绿素的降解。以上研究结果表明,FaNYE1编码一个类似AtNYE1的叶绿素降解代谢调控蛋白,在调控高羊茅叶绿素降解过程中起着重要的作用。AtNAP是拟南芥中一种与衰老相关的转录因子,在衰老过程中起着重要的调控作用。本实验利用cDNA末端快速扩增技术,在高羊茅中分离了一个AtNAP的同源基因FaNAP,并对其进行了功能分析。FaNAP全长1305bp,包含一个1023bp长的开放阅读框,编码一个含有340个氨基酸残基的多肽,其基因组含有2个内含子,3个外显子。序列分析显示,FaNAP与来源于小麦、大麦、水稻、玉米、粗山羊草、大豆等物种的NAP具有很高的同源性。对FaNAP的表达模式分析显示,衰老和黑暗均能显著诱导FaNAP的表达,但衰老诱导更为强烈。FaNAP在拟南芥中的功能分析表明,FaNAP能够异源互补拟南芥nap突变体滞绿表型,组成型过表达FaNAP能够明显促进植物的衰老且衰老程度与植株体内FaNAP的表达量成正相关。以上研究结果表明,FaNAP编码一个类似拟南芥AtNAP的衰老相关转录因子,在调控高羊茅叶片衰老进程中应起着重要的作用。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
综述  8-21
  1. 滞绿与滞绿突变体  8-9
    1.1 滞绿的概念  8
    1.2 滞绿突变体的类型  8-9
    1.3 滞绿突变体的应用前景  9
  2. 叶绿素降解代谢的关键调控蛋白NYE1  9-10
  3. 叶绿素降解  10-13
    3.1 叶绿素的降解途径  10-12
    3.2 叶绿素降解途径中的酶  12-13
    3.3 叶绿素降解的意义  13
  4. 植物衰老相关的调控转录因_子  13-14
    4.1 植物衰老  13-14
    4.2 NAC转录因子与衰老调控转录因子AtNAP  14
  5. cDNA末端快速扩增技术(RACE)  14-19
    5.1 3’-RACE的原理  15-16
    5.2 5’-RACE的原理  16-19
  6. 草坪型高羊茅  19-21
材料和方法  21-53
  第一章 高羊茅中AtNYE1同源基因的克隆及其功能研究  21-44
    1. 实验材料  21-22
      1.1 植物材料与生长条件  21
      1.2 菌种  21
      1.3 载体  21
      1.4 试剂和培养基  21-22
    2. 实验方法  22-44
      2.1 RNA提取  22
      2.2 RNA检测  22-23
      2.3 RNA定量  23
      2.4 cDNA第一链合成和反转录PCR  23-24
      2.5 RT-PCR扩增FaNYE1基因保守片断  24
      2.6 DNA片段的回收、连接、克隆和测序  24-27
      2.7 FaNYE1的3’末端序列的扩增  27-29
      2.8 5’RACE法扩增FaNYE15’末端序列  29-32
      2.9 FaNYE1全长cDNA序列的获得  32
      2.10 FaNYE1基因组序列的获得  32-33
      2.11 DNA和蛋白序列生物信息学分析  33
      2.12 FaNYE1表达模式分析  33-35
      2.13 FaNYE1互补拟南芥突变体nye1-1  35-40
      2.14 野生型拟南芥中过表达FaNYE1  40-41
      2.15 高羊茅FaNYE1 RNAi  41-44
  第二章 高羊茅中AtNAP同源基因的克隆及其功能研究  44-53
    1. 材料  44
    2. 实验方法  44-53
      2.1 高羊茅RNA抽提、检测、定量以及第一链cDNA的合成  44
      2.2 RT-PCR扩增FaNAP基因保守片断  44
      2.3 FaNAP 3’末端序列的扩增  44-46
      2.4 FaNAP 5’末端序列的扩增  46-48
      2.5 FaNAP全长cDNA序列的获得  48
      2.6 FaNYE1基因组序列的获得  48-49
      2.7 DNA和蛋白序列生物信息学分析  49
      2.8 FaNAP表达模式的分析  49-50
      2.9 FaNAP互补拟南芥nap突变体  50-51
      2.10 野生型拟南芥中组成型过表达FaNAP  51-53
实验结果  53-71
  第一章 高羊茅中AtNYE1同源基因的分离及其功能分析  53-63
    1. FaNYE1全长cDNA序列的获得  53-54
    2. FaNYE1基因组序列的获得  54-55
    3. FaNYE1生物信息学分析  55-58
      3.1 一级结构序列分析  55
      3.2 二级结构预测  55-56
      3.3 亚细胞定位预测  56
      3.4 FaNYE1与其他物种来源的NYE1蛋白的多重序列比对分析  56-57
      3.5 FaNYE1的系统进化树分析  57-58
    4. FaNYE1表达模式分析  58-60
    5. FaNYE1能够异源互补拟南芥滞绿突变体nye1-1  60-61
    6. 组成型过表达FaNYE1能够明显促进叶绿素降解  61-63
  第二章 高羊茅中AtNAP同源基因的克隆及其功能研究  63-71
    1. FaNAP全长cDNA序列的获得  63-64
    2. FaNAP基因组序列的获得  64-65
    3. FaNAP生物信息学分析  65-67
      3.1 一级结构序列分析  65
      3.2 二级结构序列分析  65-66
      3.3 多重序列比对  66
      3.4 FaNAP的系统进化树分析  66-67
    4. FaNAP表达模式的分析  67-68
    5. FaNAP能够互补拟南芥nap突变体  68-69
    6. 过表达FaNAP能够显著促进植物叶片的衰老进程  69-71
讨论  71-73
参考文献  73-78
致谢  78-79

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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