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康氏木霉与酿酒酵母原生质体融合构建产酒精新菌株

作　者: 白晓青
导　师: 袁耀武
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母康氏木霉原生质体遗传标记细胞融合育种
分类号: TS262.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

原生质体融合技术是一种微生物育种方法,该方法简便、易行。利用该方法选育目的菌株的过程中仍然存在许多需要解决的问题。本试验以康氏木霉和酿酒酵母为出发菌株,对原生质体融合技术进行了研究,确定了纤维素酶高产菌株康氏木霉原生质体制备及再生的适宜条件,为该菌细胞融合和诱变育种提供适宜的真菌状态。同时对融合株的一些遗传性状进行了相关研究。该研究为微生物育种工作奠定了基础。本试验对影响康氏木霉原生质体形成和再生的各种因素(菌龄,蜗牛酶浓度,酶解温度和时间,渗透压稳定剂的成份和浓度)进行试验比较。结果表明,康氏木霉原生质体制备的最佳条件:菌龄为22 h,蜗牛酶浓度为2.0%,酶解温度为30℃,酶解时间为2.5 h,蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为0.6 mol/L NaCl,在制备康氏木霉原生质体时观察到原生质体的释放方式主要有两种:顶端释放和段端位释放。本试验原生质体制备方法可以获得细胞融合和细胞突变诱导所需要的原生质体数量。本试验对康氏木霉原生质体的再生培养基进行了研究,确定了康氏木霉原生质体的最佳再生培养基为0.8 mol/L蔗糖YPD再生培养基,康氏木霉原生质体在0.8 mol/L蔗糖YPD再生培养基上平均再生菌落数为4.13×105个/mL。同时观察到了康氏木霉原生质体的一种再生方式。本试验采用抗药性遗传标记和热灭活两种方法作为融合菌株的筛选标记,确定了制霉菌素的标记浓度为750 U/mL,无水乙醇的标记浓度为23%。康氏木霉的热灭活温度为67℃,时间为10 min。本试验采用康氏木霉原生质体单亲热灭活(酿酒酵母采用抗药性遗传标记)和双亲均采用抗药性遗传标记两种方法共筛出246株融合菌株。本试验初筛采用TTC作为显色剂筛选出发酵葡萄糖能够产酒精的融合株,然后将此融合菌株在羧甲基纤维素钠培养基上进行复筛,筛选出分解葡萄糖产水解圈较大的融合株,TTC和羧甲基纤维素钠培养基能够筛选出既产酒精又产纤维素酶的融合株。将筛选出的融合株进行遗传稳定性试验最终得到4株稳定融合菌株。本试验最后对遗传性稳定的4株融合菌株进行了个体形态、生化特性、特定基因序列和可溶性蛋白等方面的遗传性质研究,研究发现:融合菌株B1、B2、B3确实进行了基因重组,但其酶活和产酒精能力都比亲本低。但是这些研究为原生质体融合育种工作提供了有益的参考。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-16
  1.1 纤维素的结构及纤维素酶  10-12
    1.1.1 自然界中纤维素  10-11
    1.1.2 纤维素酶  11-12
  1.2 纤维素生产乙醇菌种选育  12-14
    1.2.1 自然界中筛选菌种  12
    1.2.2 基因突变选育菌种  12-13
    1.2.3 基因重组育种  13
    1.2.4 原生质体融合育种技术  13-14
  1.3 本试验研究的目的意义  14-15
  1.4 本试验研究内容  15-16
2 材料与方法  16-26
  2.1 试验材料  16-18
    2.1.1 出发菌株  16
    2.1.2 培养基  16
    2.1.3 其它试剂及原料  16-17
    2.1.4 主要仪器设备  17-18
  2.2 试验方法  18-25
    2.2.1 康氏木霉和酿酒酵母个体形态的观察  18
    2.2.2 影响康氏木霉原生质体形成条件的研究  18-19
    2.2.3 康氏木霉和酿酒酵母原生质体的制备  19
    2.2.4 康氏木霉原生质体释放方式的观察  19
    2.2.5 康氏木霉和酿酒酵母原生质体形态观察  19-20
    2.2.6 康氏木霉原生质体最佳再生培养基的确定试验  20
    2.2.7 影响康氏木霉原生质体再生条件的研究  20
    2.2.8 康氏木霉原生质体再生率的测定  20-21
    2.2.9 康氏木霉原生质体再生方式的观察  21
    2.2.10 康氏木霉原生质体热灭活条件的确定  21
    2.2.11 康实木霉和酿酒酵母抗药性遗传标记的确定  21-22
    2.2.12 康氏木霉和酿酒酵母原生质体的融合  22
    2.2.13 纤维素酶活的测定  22-23
    2.2.14 融合菌落的检出  23
    2.2.15 稳定融合株获得及遗传稳定性鉴定试验  23-24
    2.2.16 双亲融合子菌落特征的观察  24
    2.2.17 双亲融合子个体形态的观察  24
    2.2.18 双亲融合子在羧甲基纤维素平板上产水解圈的观察  24
    2.2.19 融合株在TTC 平板上显色情况的观察  24
    2.2.20 双亲和融合子总DNA 提取方法  24-25
    2.2.21 双亲和融合株265 rDNA 的扩增  25
    2.2.22 双亲和融合株可溶性蛋白质的提取  25
    2.2.23 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离可溶性蛋白质  25
  2.3 双亲和融合菌株发酵产酒精  25-26
3 结果与分析  26-47
  3.1 康氏木霉和酿酒酵母个体形态观察结果  26-27
  3.2 影响康氏木霉原生质体形成条件的研究结果  27-30
    3.2.1 菌丝体培养时间对原生质体形成的影响  27
    3.2.2 酶组成对原生质体形成的影响  27-28
    3.2.3 蜗牛酶浓度对原生质体形成的影响  28
    3.2.4 酶解时间对原生质体形成的影响  28-29
    3.2.5 酶解温度对原生质体形成的影响  29
    3.2.6 蜗牛酶溶液中渗透压稳定剂对原生质体形成的影响  29-30
  3.3 康氏木霉原生质体形态及原生质体释放方式  30-31
  3.4 康氏木霉原生质体最佳再生培养基的确定  31-32
    3.4.1 初试结果  31-32
    3.4.2 再生培养基中稳渗剂最佳浓度的试验结果  32
  3.5 影响康氏木霉原生质体再生条件的研究结果  32-34
    3.5.1 蜗牛酶浓度对原生质体再生的影响  32-33
    3.5.2 酶解温度对原生质体再生的影响  33-34
  3.6 康氏木霉原生质体再生方式的观察  34
  3.7 康氏木霉原生质体热灭活条件的确定结果  34-35
  3.8 康氏木霉和酿酒酵母抗药性遗传标记的确定  35-38
    3.8.1 药品的筛选  35
    3.8.2 放线菌酮对康氏木霉和酿酒酵母的致死浓度测定  35-36
    3.8.3 制霉菌素对康氏木霉和酿酒酵母的致死浓度测定  36-37
    3.8.4 无水乙醇对康氏木霉和酿酒酵母的致死浓度测定  37-38
  3.9 原生质体融合结果  38-39
    3.9.1 融合现象的观察  38-39
    3.9.2 融合方法一（双亲均采用抗药性遗传标记）试验结果  39
    3.9.3 融合方法二（康氏木霉单亲热灭活，酿酒酵母采用抗药性遗传标记）试验结果  39
  3.10 葡萄糖标准曲线的制备  39-40
    3.10.1 葡萄糖标准溶液OD_(540)nm 下的测定结果  39-40
    3.10.2 葡萄糖标准曲线  40
  3.11 融合菌落的检出结果  40-43
    3.11.1 融合菌落的初检结果  40-42
    3.11.2 融合菌落的复检结果  42-43
  3.12 稳定融合株的获得及遗传稳定性试验结果  43
  3.13 双亲融合子遗传性质的研究结果  43-46
    3.13.1 双亲融合子菌落特征观察  43-44
    3.13.2 双亲融合子个体形态的观察结果  44
    3.13.3 双亲和融合株总DNA 提取的研究结果  44-45
    3.13.4 双亲和融合株265 rDNA 的扩增结果  45
    3.13.5 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离可溶性蛋白质的结果  45-46
  3.14 双亲和融合株发酵产酒精的试验结果  46-47
4 讨论  47-49
  4.1 关于康氏木霉原生质体制备和再生  47
  4.2 关于康氏木霉和酿酒酵母抗药性遗传标记  47-48
  4.3 关于双亲融合子遗传性质的研究  48
  4.4 融合子酶活和产酒精能力的研究  48-49
5 结论  49-51
6 参考文献  51-55
在读期间发表的学术论文  55-56
作者简历  56-57
致谢  57-58

康氏木霉与酿酒酵母原生质体融合构建产酒精新菌株

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