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阿维拉霉素高产菌的选育与发酵工艺研究

作　者: 李政
导　师: 陶兴无
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 阿维拉霉素发酵表面活性剂原生质体融合菌种选育产绿链霉素Tü57
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

阿维拉霉素又称卑霉素,是寡糖霉素族类抗生素,作为饲料添加剂应用于畜牧业上可防治禽畜腹泻,提高存活率,并可提高饲料转化率,具有明显的育肥和促生长作用。本文从其理化性质,菌种诱变筛选方法,培养基及发酵条件等方面做了研究。本实验以产绿链霉菌Tü57( Streptomyces viridochromogenes Tü57)为出发菌株,以阿维拉霉素A的含量为指标成分进行正向突变体的筛选。我们首先通过紫外线诱变和化学诱变技术诱变原始出发菌株并筛选到了符合要求的正向突变菌株,阿维拉霉素A的产量由8.62mg/L提高到15.26mg/L。然后在此基础上,通过原生质体多轮递推融合技术,将通过不同途径筛选获得的突变体进行了融合重组,获得了产量进一步提高的突变体,产量由15.26mg/L提高到52.62mg/L。在筛选突变子的过程中,本文尝试用薄层—紫外分光光度法检测阿维拉霉素的含量,进行初筛。该法以二氯甲烷-甲醇( 9: 1)做为展开剂,在HF254硅胶板上点样展层后,刮取有效斑点,以甲醇溶出,置紫外212.0 nm处测定吸光度,与标准曲线对照,求出其含量,工作曲线在10～60μg/ml范围内线性关系良好, R2=0.9988,平均回收率在100.5%。该方法操作较简便,快速,准确,尤其适合应用于目前阿维拉霉素高产菌大规模筛选时发酵液含量的测定。对初筛得到的高产菌株,以高效液相色谱法完成菌株的复筛。根据阿维拉霉素为细胞内产物的原理,通过向培养基中添加大孔树脂X-5和表面活性剂吐温-80,尝试通过大孔树脂吸附发酵液中的阿维拉霉素,利用表面活性剂改变细胞膜的通透性,降低阿维拉霉素代谢合成的负反馈抑制作用,改善发酵时气液表面的状态以及发酵液流动性的功能,以提高抗生素发酵产量。结果表明,培养基中添加6%的大孔树脂X-5和0.3%的吐温-80时可显著提高抗生素的发酵产量。该菌株的发酵产量进一步由52.62mg/L提高了至87.14mg/L。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第1章文献综述  10-20
  引言  10
  第1节阿维拉霉素的结构和理化性质  10-11
  第2节阿维拉霉素的功能及其应用价值  11-13
    （一）促生长作用  11-12
    （二）安全性  12-13
  第3节阿维拉霉素的研究现状  13-18
    （一）阿维拉霉素合成基因簇的研究  13-14
    （二）阿维拉霉素合成基团的推断  14-16
    （三）阿维拉霉素诱变和筛选方法研究  16-17
    （四）阿维拉霉素的效价检测方法  17
    （五）发酵条件及培养基优化  17-18
    （六）存在的问题及前景展望  18
  第四节本文研究内容和意义  18-20
第2章阿维拉霉素的含量检测及高产菌筛选方法  20-28
  一菌种  20
  二主要实验试剂及仪器  20-21
  三培养基  21
  四实验操作方法  21-27
    （一）菌种发酵培养  21
    （二）二剂量法定量检测阿维拉霉素产量  21-22
    （三） UV-TLC 薄层色谱定性检测阿维拉霉素  22-25
    （四）高效液相色谱法检测产量  25-27
  五本章小结  27-28
第3章紫外线和 NTG 诱变选育阿维拉霉素高产菌  28-36
  一实验材料及方法  29-30
    （一）菌种  29
    （二）培养基及缓冲液  29-30
    （三）主要实验试剂  30
    （四）主要实验仪器  30
  二实验操作步骤  30-31
    （一）活化菌株制备孢子悬液  30
    （二）诱变条件的选择  30-31
    （三）突变菌株的筛选  31
  三实验结果  31-35
    （一）紫外线对出发菌的杀伤效果  31-33
    （二） NTG 对出发菌株的杀伤效果  33-34
    （三）链霉素对出发菌株抑制效果  34-35
    （四）突变菌株的表型分布  35
  四本章小结  35-36
第4章原生质体多轮递推融合技术重组及筛选高产菌  36-43
  一菌种  36
  二主要仪器  36
  三培养基  36-37
  四筛选方法  37-38
  五实验步骤及操作  38
    （一）确定溶菌酶处理菌株的时间  38
    （二）融合重组两种不同来源的原生质体  38
    （三）筛选重组子  38
  六实验结果  38-42
    （一）溶菌酶破壁效果  38-39
    （二）原生质体再生率  39-40
    （三）原始出发菌株和筛选到的高产菌的液相图谱  40-42
  七本章小结  42-43
第5章表面活性剂耦联原位萃取发酵对阿维拉霉素产量的影响  43-49
  一材料  43-44
    （一）菌种  43
    （二）培养基  43
    （三）主要试剂  43-44
  二主要仪器  44
  三阿维拉霉素产量检测  44
  四菌株稳定性实验  44-45
  五菌株发酵实验  45
    （一）制备种子培养液  45
    （二）发酵培养  45
    （三）大孔树脂种类及用量  45
    （四）表面活性剂的种类及用量  45
  六实验结果  45-47
  七本章小结  47-49
第6章本文总结  49-51
  一结论  49
  二创新点  49-51
参考文献  51-56
致谢  56-57
攻读学位期间的研究成果  57

阿维拉霉素高产菌的选育与发酵工艺研究

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