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酿酒酵母代谢木糖工程菌的构建

作　者: 张凤琴
导　师: 汤斌
学　校: 安徽工程大学
专　业: 发酵工程
关键词: 休哈塔假丝酵母 木糖还原酶 木糖醇脱氢酶 pYES2-XYL1-XYL2 酿酒酵母工程菌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


生物质能源是可再生能源的重要组成部分,以生物质为原料生产燃料乙醇有着广阔的市场前景。燃料乙醇是一种便捷、清洁的可再生能源,因此世界很多国家已将其纳入能源战略发展规划。廉价易得的原料和高效的生产工艺是燃料乙醇工业化生产的必备条件,以可再生木质纤维素为原料生物转化制取乙醇已成为当前的研究热点,木糖是木质纤维素水解液中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,木糖的高效转化是木质纤维素生物法制取乙醇的关键技术之一。目前,对木糖高效发酵产乙醇菌株的研究是一项热门课题。本论文主要进行两个方面研究。一是从休哈塔假丝酵母中提取其基因组DNA,以其为模板,扩增得到木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因。将其重组到质粒pYES2上,构建得到重组质粒pYES2-XYL1-XYL2。将其转化酿酒酵母INVScl,得到重组酿酒酵母菌株。二是对构建的酿酒酵母工程菌进行酶活性鉴定,摇瓶发酵,并对其发酵条件进行初步研究。通过研究,取得以下研究成果：(1)采用经诱变并不断驯化得到的优良菌株休哈塔假丝酵母作为出发菌株,通过酚-氯仿法提取其基因组DNA,以该基因组DNA为模板,经PCR扩增得到主要的木糖代谢酶木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2。将测序结果与GenBank上的序列进行比对,核苷酸同源性分别为99%和98%,蛋白质的同源性均为100%。(2)将基因XYL1及XYL2分别与质粒pYES2连接得到重组质粒pYES2-XYL1和pYES2-XYL2,并以pYES2-XYL1为模板,扩增得到含半乳糖启动子的XYL1片段PGAL-XYL1。将该片段连接到重组质粒pYES2-XYL2,构建得到重组质粒pYES2-XYL1-XYL2。将该重组质粒转化酿酒酵母INVSc1,成功获得了木糖代谢酿酒酵母工程菌。(3)通过试验得到酿酒酵母工程菌的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶酶活分别为O.83U/mg和1.04U/mg,而未重组的酿酒酵母无木糖还原酶和木糖醇脱氢酶活性,因而可知木糖还原酶和木糖醇脱氢酶在酿酒酵母中得到了表达。继而对初始木糖浓度,初始pH,温度,摇床转速等发酵条件进行了研究,初步确定此酿酒酵母工程菌发酵产乙醇的最佳条件为：木糖初始浓度为100g/L,初始pH为5.5,温度为33℃,前5h转速为150rpm,后转速变为50rpm,直至发酵结束,在此条件下,乙醇和木糖醇产量分别为33.45g/L和14.85 g/L。本研究成功构建了一株能够代谢木糖的酿酒酵母工程菌,该菌株具有耐高浓度糖和较高浓度酒精的能力。此外,本研究采用的双基因单载体的方法,为该研究提供了一种单载体克隆多基因的可行方法。

全文目录


摘要  5-7ABSTRACT  7-10目录  10-13第1章 绪论  13-25  1.1 选题意义  13-15  1.2 国内外研究现状  15-24    1.2.1 发酵木糖产乙醇的代谢机理研究  16-17    1.2.2 发酵木糖产乙醇的菌种选育  17-24  1.3 研究目的及研究内容  24-25    1.3.1 研究目的  24    1.3.2 研究内容  24-25第2章 木糖代谢酶基因的克隆  25-35  2.1 试验材料  25-26    2.1.1 菌种及质粒  25    2.1.2 培养基  25-26    2.1.3 主要试剂及仪器  26  2.2 试验方法  26-32    2.2.1 平板培养  26-27    2.2.2 液体培养  27    2.2.3 基因组DNA的获取  27    2.2.4 木糖代谢关键酶基因的扩增  27-32  2.3 试验结果  32-34    2.3.1 木糖代谢关键酶基因的扩增结果  32    2.3.2 测序结果  32-34  2.4 小结  34-35第3章 重组酿酒酵母工程菌的构建  35-53  3.1 试验材料  35-37    3.1.1 菌种及载体  35    3.1.2 培养基  35-36    3.1.3 主要试剂及仪器  36-37  3.2 试验方法  37-46    3.2.1 质粒pYES2的提取  37-38    3.2.2 pYES2-XYL1的构建  38-40    3.2.3 带有半乳糖启动子的XYL1基因的扩增  40-42    3.2.4 重组质粒pYES2-XYL2的构建  42-43    3.2.5 重组质粒pYES2-XYL1-XYL2的构建  43-46  3.3 试验结果  46-52    3.3.1 质粒pYES2的提取结果  46    3.3.2 P_(GAL)-XYL1的获得及测序  46-49    3.3.3 重组质粒pYES2-XYL2的双酶切鉴定  49    3.3.4 重组质粒pYES2-XYL1-XYL2的构建及鉴定  49-52  3.4 小结  52-53第4章 重组酿酒酵母工程菌的发酵  53-66  4.1 试验材料  53-54    4.1.1 菌种  53    4.1.2 培养基  53    4.1.3 主要试剂及仪器  53-54  4.2 试验方法  54-57    4.2.1 XR和XDH酶活测定  54-55    4.2.2 木糖浓度的测定  55-56    4.2.3 醇浓度的测定  56    4.2.4 pH值的测定  56    4.2.5 生长曲线的测定  56    4.2.6 摇瓶发酵及产物乙醇分析  56-57  4.3 试验结果  57-65    4.3.1 XR和XDH酶活测定结果  57-59    4.3.2 好氧生长  59    4.3.3 摇瓶发酵  59-65  4.4 小结  65-66第5章 结论与展望  66-68  5.1 结论  66  5.2 展望  66-68参考文献  68-73本人在攻读硕士学位期间发表的学术论文  73-74致谢  74

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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