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牛肝碱性磷酸酶的分离纯化、部分性质和功能基团及固定化研究

作　者: 唐靓婷
导　师: 唐云明
学　校: 西南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 牛肝碱性磷酸酶分离纯化性质功能基团固定化
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

以新鲜的牛肝为材料,经匀浆、Tris-HCl缓冲液抽提、正丁醇除脂、热变性、超滤、DEAE-Sepharose离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,分离纯化出牛肝碱性磷酸酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该酶已达到电泳纯。纯化倍数达228.74倍,比活为19863.50U／mg.经SDS-PAGE和凝胶过滤测得该酶的亚基分子量为59 Kd,全分子量为118 Kd。以磷酸苯二钠为底物,测得该酶的最适pH为10.0,最适温度为45℃。Na+、K+、Li+等一价离子对该酶活性基本无影响,Mg2+对该酶活性有激活作用,Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+对该酶活性有抑制作用,Km为1.12mmo1／L。分别采用对氯汞苯甲酸(PCMB)、乙酰丙酮(BD)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二巯基苏糖醇(DTT)、琥珀酸酐(SUAN).N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、碘乙酸(IAc)这七种化学修饰剂,在一定条件下选择性的修饰牛肝碱性磷酸酶的氨基酸侧链,结果表明：DTT.SUAN、NBS、IAc这四种化学修饰剂能显著的抑制牛肝碱性磷酸酶的活力,并且酶活力的降低与修饰剂浓度的成正相关。而DTT、SUAN、NBS、IAc能选择性的修饰蛋白质中的二硫键、ε-氨基、色氨酸残基、组氨酸残基。因此我们认为,ε-氨基、色氨酸残基、组氨酸残基是牛肝碱性磷酸酶活性中心所必需的功能基团,而二硫键对于维持酶活性中心的结构也是必需的。分别采用海藻酸钠、聚乙烯醇-海藻酸钠为载体固定牛肝碱性磷酸酶。对两种载体固定化方法的单因素实验条件进行优化,并进行了正交优化试验。再对两种方法下的固定化酶进行性质研究,通过实验分别测定出两种固定化酶的最适温度、最适酸碱度和储存稳定性。实验结果：通过海藻酸钠固定法的实验条件优化,确定海藻酸钠的最适浓度为1%,海藻酸钠与酶液的最适比例为3：1,氯化钙的最适浓度为0.5%,固定化酶在氯化钙中放置的最适时间为30min。通过海藻酸钠固定法的正交优化试验,确定CA:AKP的最佳水平为3：1,CA浓度最佳水平为2%,氯化钙浓度的最佳水平为0.2%。海藻酸钠固定法的酶回收率最高可以达到80%。海藻酸钠固定化酶的最适温度为45℃,最适pH值为pH9.5,在30天内,固定化酶的剩余酶活力达到了75%.说明海藻酸钠固定化酶在4℃下具有较好的储存稳定性。通过聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的实验条件优化,确定聚乙烯醇的最适浓度为1%,海藻酸钠的最适浓度为1%,聚乙烯醇-海藻酸钠与酶液的最适比例为4：1,氯化钙的最适浓度为0.5%,固定化酶在氯化钙中放置的最适时间为30min。通过聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的正交优化试验,确定PVA浓度的最佳水平为1.5%,氯化钙浓度的最佳水平为0.2%、CA浓度最佳水平为1.5%,PVA-CA:AKP的最佳水平为4：1,聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的酶回收率最高可以达到95.1%。聚乙烯醇-海藻酸钠固定化酶的最适温度为40℃,最适pH值为10.5。在三十天内,固定化酶的剩余酶活力达到了94%.说明PVA-CA固定化酶在4℃下具有良好的储存稳定性。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
第一章文献综述  9-17
  1.1 碱性磷酸酶的性质及功能研究  9-11
  1.2 碱性磷酸酶的分离纯化研究  11-12
  1.3 金属离子及有机物对该酶的影响研究  12-13
  1.4 碱性磷酸酶的检测方法研究  13-14
  1.5 碱性磷酸酶的同工酶研究  14
  1.6 碱性磷酸酶的固定化研究  14-17
第二章引言  17-19
  2.1 本研究的目的和意义  17
  2.2 本研究的主要试验内容  17-19
第三章牛肝碱性磷酸酶的分离纯化及性质研究  19-27
  3.1 材料与试剂  19-20
  3.2 实验方法  20-22
  3.3 实验结果与分析  22-27
第四章牛肝碱性磷酸酶的功能基团研究  27-33
  4.1 材料与试剂  27
  4.2 实验方法  27-28
  4.3 实验结果与分析  28-33
第五章牛肝碱性磷酸酶固定化方法的研究  33-47
  5.1 材料与试剂  33
  5.2 主要设备  33
  5.3 实验方法  33-36
  5.4 实验结果与分析  36-47
第六章讨论  47-53
  6.1 牛肝碱性磷酸酶的分离纯化  47
  6.2 牛肝碱性磷酸酶的性质研究  47-48
  6.3 部分金属离子对牛肝碱性磷酸酶的影响  48
  6.4 牛肝碱性磷酸酶的功能基团研究  48-50
  6.5 牛肝碱性磷酸酶固定化方法的研究  50-51
  6.6 展望  51-53
参考文献  53-57
致谢  57

牛肝碱性磷酸酶的分离纯化、部分性质和功能基团及固定化研究

内容摘要

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