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雷竹成花相关基因的克隆研究

作　者: 林绕
导　师: 方伟；林新春
学　校: 浙江林学院
专　业: 森林培育
关键词: 雷竹花发育的组织发生学成花相关基因克隆 SSH
分类号: S795
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 71次
引　用: 2次
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内容摘要

雷竹(Phyllostachys violascens)具有出笋早、产量高、经济效益显著等特点,是我国特有的优良笋用竹种。目前在我省及南方各省区得到大面积推广,产生了良好的经济、社会和生态效益。近年来,由于雷竹开花现象越来越普遍,开花竹林产量逐年下降,甚至成片衰老死亡,使生产蒙受了巨大的损失。高等植物成花是一个复杂的基因网络调控过程,开花是各种成花基因表达的结果。目前植物成花过程的研究已经形成了一套较为完整的理论体系,但有关竹子成花机理的研究非常薄弱,主要停留在开花行为和开花原因的讨论上,而对竹子成花的分子机理研究非常少。因此,开展雷竹成花相关基因克隆的研究,探讨竹子成花的分子机理,具有较强的理论和现实意义。本研究运用扫描电镜、石蜡切片等手段,对雷竹花发育的组织发生学进行了研究,并在此基础上利用抑制性差减杂交技术(SSH)对雷竹的成花相关基因进行了克隆,结果表明:(1)雷竹花发育的不同阶段与雷竹花芽(实际为花序)长度存在一定的对应关系:1、花序长度<6mm,花序基本上还未分化,顶芽还处于原套原体状态;2、花序长度在6～8mm时为花序分化阶段,侧芽基本形成;3、花序长度在8～12mm时为颖花分化阶段,雌蕊原基、雄蕊原基基本形成;4、花序长度>12mm为花器官发育阶段。(2)以来自于同一竹鞭的雷竹开花竹株和不开花竹株为研究对象,以开花竹株长度为6～12mm的花芽为检测子(tester),以相应的不开花竹株的叶芽为驱动子(driver),利用抑制性差减杂交技术构建了雷竹成花差减cDNA文库,并通过点杂交筛选得到29个阳性克隆。测定了阳性克隆序列,并对其功能进行了分析和预测。在此基础上,利用RT-PCR分析29个阳性克隆在雷竹花芽和叶芽中的表达,共得到19个在雷竹花芽中表达上调的基因。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
1 文献综述  7-17
  1.1 高等植物成花基因的研究现状  7-12
    1.1.1 花序分生组织特征基因  7-8
    1.1.2 花分生组织特征基因  8-10
      1.1.2.1 LFY  8-9
      1.1.2.2 AP1  9
      1.1.2.3 其他花分生组织特征基因  9-10
    1.1.3 花器官特征基因  10-12
      1.1.3.1 ABC 模型及其发展  10-11
      1.1.3.2 花器官特征基因  11-12
  1.2 竹子成花机理的研究现状  12-13
  1.3 抑制性差减杂交技术及其研究进展  13-15
    1.3.1 抑制性差减杂交技术的原理  13-14
    1.3.2 抑制性差减杂交技术的特点  14
      1.3.2.1 抑制性差减杂交技术的优点  14
      1.3.2.2 抑制性差减杂交技术的缺点  14
    1.3.3 抑制性差减杂交技术在植物中的应用  14-15
  1.4 展望  15-16
  1.5 研究思路与意义  16-17
2 雷竹花发育的组织发生学研究  17-23
  2.1 材料与方法  17-18
    2.1.1 实验材料  17
    2.1.2 实验方法  17-18
      2.1.2.1 雷竹花芽扫描电镜观测  17
      2.1.2.2 雷竹花芽石蜡切片观测  17-18
  2.2 结果  18-19
  2.3 讨论  19-23
3 雷竹成花相关基因的克隆  23-45
  3.1 材料与方法  23-33
    3.1.1 雷竹材料  23
    3.1.2 总RNA 提取和mRNA 分离  23-24
      3.1.2.1 总RNA 提取  23-24
      3.1.2.2 mRNA 分离  24
    3.1.3 抑制性差减杂交  24-29
      3.1.3.1 第一链cDNA 合成  24-25
      3.1.3.2 第二链cDNA 合成  25
      3.1.3.3 RsaⅠ酶切  25-26
      3.1.3.4 衔接子链接  26-27
      3.1.3.5 第一次杂交  27
      3.1.3.6 第二次杂交  27-28
      3.1.3.7 PCR 扩增  28-29
    3.1.4 SSH cDNA 文库的构建  29-30
      3.1.4.1 PCR 产物回收  29
      3.1.4.2 连接  29
      3.1.4.3 转化  29-30
    3.1.5 差减cDNA 文库的差异筛选  30-32
      3.1.5.1 cDNA Blot 阵列制备  30-31
      3.1.5.2 探针的制备  31
      3.1.5.3 点杂交  31-32
    3.1.6 测序及序列相似性搜索  32
    3.1.7 阳性克隆的RT-PCR 分析  32-33
      3.1.7.1 cDNA 第一链合成  32
      3.1.7.2 引物设计  32
      3.1.7.3 部分阳性克隆的RT-PCR 分析  32-33
  3.2 结果  33-34
    3.2.1 总RNA 与mRNA 质量检测  33
    3.2.2 抑制性差减杂交后两次PCR 产物分析  33
    3.2.3 差减cDNA 文库的构建与差异克隆筛选  33-34
      3.2.3.1 差减cDNA 文库插入片段检测  33
      3.2.3.2 差减cDNA 文库的差异筛选  33-34
    3.2.4 测序结果与分析  34
    3.2.5 阳性克隆的RT-PCR 分析  34
  3.3 讨论  34-45
    3.3.1 雷竹成花相关基因的功能分析  34-37
      3.3.1.1 泛素基因  34-35
      3.3.1.2 环境胁迫应答基因  35-36
      3.3.1.3 核糖体蛋白基因  36-37
      3.3.1.4 未知基因  37
    3.3.2 抑制性差减杂交技术  37-45
4 结论  45-46
参考文献  46-55
缩写词（ABBREVIATION）  55-57
个人简历  57-58
致谢  58

雷竹成花相关基因的克隆研究

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