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伪狂犬病病毒IE180基因的克隆、原核表达及其以减毒沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗免疫效力研究

作　者: 徐亮
导　师: 郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 伪狂犬病病毒 IE180基因原核表达减毒猪霍乱沙门氏菌C500 DNA疫苗免疫效力
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本研究以猪伪狂犬病病毒（PRV）Fa毒株为材料,通过聚合酶链式反应（PCR）方法将IE180基因分为两段扩增,并将其定向连接至pMD18-T Simple克隆载体。对所获得的目的基因进行原核表达载体构建、原核表达,真核表达载体构建及其以减毒沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗的免疫效力的研究。主要研究内容如下:1.IE180基因的分段克隆参照GenBank中登录号为AF352564的PRV TNL株的IE180基因序列,利用IE180基因中自带的且唯一的NcoⅠ酶切位点,在此位点前后设计两对特异性引物。以本实验室保存的PRV Fa株为材料,扩增出前后两个片段后分别连至pMD18-T Simple载体,命名为pMD-Ⅰ和pMD-Ⅱ。对载体进行双酶切,回收pMD-Ⅰ质粒的1.8kb片段（IE180基因的前半段）和pMD-Ⅱ质粒的5.2kb片段（连接有IE180基因后半段的pMD18-TSimple载体）。对回收的目的条带进行连接,得到连接于pMD18-T Simple载体的IE180全基因,命名为pMD-IE180。通过酶切鉴定及序列测定,证实成功克隆出IE180基因。序列测定显示,克隆出4389bp的ORF,G+C含量为79.9%,编码1462个氨基酸,推算出的分子量是150,117Da。2.IE180基因原核表达载体构建、原核表达及IE180蛋白活性检测采用EcoRⅠ、SalⅠ对之前得到的pMD-IE180基因克隆载体进行双酶切,回收4.4kb大小IE180基因片段,然后利用原核表达载体pET-32a（+）中的多克隆酶切位点,将目的片段定向插入其中,构建了原核表达载体pET-IE180。阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导融合表达。经SDS-PAGE检测,重组菌诱导后样品在200 kD左右有明显的融合蛋白条带,但蛋白表达量较小。试验确定IE180蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.2mmol/L,37℃诱导培养4h,表达出的IE180蛋白主要以包涵体的形式存在。使用Western Blot方法对纯化复性后的包涵体进行检测,证实其具有免疫活性。3.IE180基因真核表达载体的构建及其以减毒沙门氏菌为运送载体的口服DNA疫苗免疫效力研究从克隆质粒pMD-IE180中酶切出IE180基因,并与酶切回收的真核表达载体pCI-neo定向连接,构建出真核表达质粒pCI-IE180,并将其电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌S.C500。将30只小鼠随机分成3组,每组10只,分别是空白对照,S.C500/pCI-neo空质粒组,S.C500/pCI-IE180重组质粒组。每2周进行一次灌胃免疫,共4次。对照组小鼠每次灌胃10%碳酸氢钠0.2mL,其余两组用分别用10%碳酸氢钠重悬细菌至10⁹个/0.2mL后灌胃0.2mL。首免后第2、4、6、8周采血分离血清,间接ELISA方法检测抗体水平。末次采血后小鼠腹腔注射0.1mL 10²³倍稀释的PRV(5倍LD₅₀)。ELISA结果显示,以减毒沙门氏菌为运送载体的pCI-IE180口服DNA疫苗具有一定的免疫原性,可以刺激小鼠机体产生一定水平的抗体（1:1600）。攻毒保护实验证实本疫苗对小鼠有一定的保护力,可以在5倍LD₅₀PRV攻毒,致使对照组全死的情况下保护约30%的小鼠存活。

伪狂犬病病毒IE180基因的克隆、原核表达及其以减毒沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗免疫效力研究

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