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不同浓度HGF及EGF体外诱导兔BMSCs向肝细胞分化的研究

作　者: 罗伟
导　师: 肖恩华
学　校: 中南大学
专　业: 影像医学与核医学
关键词: 骨髓间充质干细胞肝细胞肝细胞生长因子表皮细胞生长因子诱导分化兔
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的通过不同浓度肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和表皮细胞生长因子(epidermal cell growth factor,EGF)体外诱导兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向肝细胞分化,以探讨HGF和EGF的最适浓度组合。方法密度梯度离心法分离兔BMSCs,体外培养,传代纯化。建立以HGF(30.0ug/L)+EGF(1.5mg/L)、HGF(40.0ug/L)+EGF(2.5mg/L)、HGF(50.0ug/L)+EGF(3.5mg/L)、HGF(60.0ug/L)+EGF(4.5mg/L)为诱导的培养体系。观察诱导细胞形态学变化,于7、14、21、28d采用免疫细胞化学及免疫荧光分别检测肝细胞表面标志甲胎蛋白(alphafetoprotein AFP)及白蛋白(albumin ALB),留取不同时段培养上清液,用溴甲酚绿法(bromcresol green BCG)检测上清液中ALB含量,用尿素合成试验检测尿素含量。结果14d开始可观察到多极性的肝细胞样细胞,呈短梭形和多角形,随诱导时间延长(21d)形成多细胞集落,各组形态学比较无明显差异。免疫细胞化学检测,7d时AFP表达阳性,14d达最大值后即开始下降(P＜0.05),各浓度组间表达无差别(P＞0.05)。免疫荧光检测,14d开始ALB表达阳性,1组、4组各时间点比较无差别(P＞0.05),2组及3组随诱导时间延长,阳性表达细胞数增加(P＜0.05)。纵向比较:总体上各组之间有显著性差异,且浓度越高,阳性细胞数越高(P＜0.05)。两两比较,在14d时1组与2组无差别,在21d时2组与3组表达无差别,28d时3组与4组表达无差别(p＞0.05)。溴甲酚绿法检测,12d细胞培养上清液中可检测到ALB,ALB含量在早期(9-15d)表现为浓度越高含量越高((P＜0.05),18或21d达高峰后下降,此时各浓度组间含量无差别(p＞0.05),最高峰值在第四组(HGF60ug/L、EGF4.5ug/L)。9d时可检测到尿素含量,各浓度组间表达无差别(p＞0.05)。结论HGF及EGF能诱导兔BMSCs分化为肝细胞,诱导时间约2-3周。诱导剂浓度与诱导分化率之间在诱导早期呈剂量依赖关系,高浓度的HGF及EGF可提高BMSCs向肝细胞的分化率。诱导剂最适组合为HGF60ug/L、EGF4.5mg/L。

全文目录

摘要  5-7
英文摘要  7-11
英中文名词对照索引  11-12
前言  12-14
第一章材料与方法  14-21
  1. 材料  14-15
    1.1 仪器与设备  14
    1.2 主要试剂  14-15
    1.3 液体的配制  15
  2. 方法  15-20
    2.1 兔BMSCs的体外分离与培养  15-17
    2.2 BMSCs的诱导分化  17-20
  3. 统计学分析  20-21
第二章结果  21-29
  1. BMSCs的生物学特性  21-22
    1.1 原代细胞  21
    1.2 传代细胞  21
    1.3 冻存与复苏  21-22
  2. 诱导后BMSCs观察及鉴定  22-29
    2.1 形态学变化  22
    2.2 免疫细胞化学检测AFP  22-23
    2.3 免疫荧光检测ALB  23-25
    2.4 溴甲酚绿法测细胞培养上清液ALB含量  25-26
    2.5 酶两点法测细胞培养上清液尿素含量  26-29
第三章讨论  29-36
  3.1 BMSCs的常用分离方法及培养条件  29-30
  3.2 BMSCs体外生长特点及冻存与复苏  30-31
  3.3 BMSCs的诱导培养条件  31-32
  3.4 BMSCs分化为肝细胞样细胞表面标志及功能表达  32-33
  3.5 分化机制探讨  33-36
第四章结论  36-37
参考文献  37-44
附图  44-56
综述  56-71
致谢  71-72
攻读硕士学位期间发表的论文  72

不同浓度HGF及EGF体外诱导兔BMSCs向肝细胞分化的研究

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