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帕金森病相关蛋白Parkin、PINK1和mortalin交互作用对线粒体稳态调控研究

作　者: 杨辉
导　师: 刘雯
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 帕金森病蛋白质相互作用线粒体功能障碍 Mortalin Parkin PINK1 RNA干扰
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Parkin作为常染色体隐性帕金森病(Parkinson’s disease, PD)常见致病基因之一,编码的蛋白具有泛素E3连接酶活性。Parkin除了通过泛素蛋白酶体途径参与底物降解,还在包括信号传导、氧化应激和线粒体稳态等方面发挥重要调控作用。PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1)作为另一个与常染色体隐性遗传PD相关致病基因,编码的蛋白质主要定位于线粒体并具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性。PINK1/Parkin通路在调控线粒体形态和功能上发挥重要作用。Mortalin是主要定位于线粒体并参与线粒体稳态调控的分子伴侣。Mortalin与PD的发病密切相关,主要证据包括PD病人mortalin基因编码区存在突变和mortalin在PD病人受影响相关脑区中表达水平下降以及mortalin与PD相关蛋白DJ-1/α-Synuclein存在相互作用。通过对携带mortalin突变的PD病人成纤维上皮细胞进行研究,发现氧化应激的发生、线粒体形态及膜电位异常。然而Parkin、PINK1和mortalin的相互作用情况及他们参与调控线粒体的具体机制仍然不清。因此在本研究中,我们主要在HeLa细胞中对Parkin和PINK1, Parkin和mortalin之间的相互作用进行研究,并观察他们对线粒体功能的影响。主要方法和结果如下：1) Parkin RING1结构域突变质粒构建。利用已构建的编码野生型Parkin质粒作为模板,经重叠延伸PCR方法获得相关RING1突变型Parkin质粒并测序证实。2) Parkin RING1结构域突变对其与PINK1的相互作用和对线粒体转位的影响。免疫荧光结果表明HeLa细胞内转染GFP标记的Parkin在胞浆、胞核均有分布,RING1结构域相关突变并未影响其亚细胞定位。当PINK1与Parkin共转染细胞后,野生型与突变型Parkin与线粒体共定位的程度显著增加。免疫共沉淀结果表明野生型Parkin与PINK1在HeLa细胞中存在相互作用,Parkin的RING1结构域突变R275W与PINK1的结合减弱。3) HeLa细胞中Parkin和mortalin的亚细胞定位及相互作用。免疫荧光结果表明内源性mortal in主要定位于线粒体,Parkin在加入CCCP后与线粒体共定位。免疫沉淀结果显示在HeLa细胞中,CCCP诱导野生型及T240R突变型Parkin与内源性mortalin存在相互作用,而Parkin的R275W及RING1 Domain缺失突变与内源性mortalin的相互结合作用十分微弱。4) Mortalin稳定低表达HeLa细胞模型构建。设计针对mortalin的相应干扰序列,通过慢病毒介导的三质粒系统共转染HEK293T细胞获得病毒上清,转染HeLa细胞并加药筛选获得mortalin稳定低表达的HeLa细胞模型。干扰效果经实时定量PCR以及免疫印迹验证。5) HeLa细胞中线粒体形态、凋亡和Parkin线粒体转位。结果表明氧化应激导致mortalin低表达HeLa细胞的线粒体和细胞核形态明显改变及凋亡率的增加,但对于Parkin的线粒体转位没有影响。6)过表达Parkin挽救mortalin低表达导致的线粒体功能障碍。通过观察不同状态下对照组、mortalin KD组、mortalin KD+Parkin组及mortalin KD+Parkin突变组HeLa细胞的的ROS、线粒体膜电位和线粒体拷贝数。实验结果表明mortalin低表达HeLa细胞表现出线粒体膜电位降低、活性氧生成增多和线粒体基因组拷贝数降低,过表达Parkin则可以挽救上述线粒体功能障碍。

帕金森病相关蛋白Parkin、PINK1和mortalin交互作用对线粒体稳态调控研究

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