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核黄素激活烟草防卫反应和诱导对两种土传病害的抗性研究

作　者: 刘菲
导　师: 梁元存
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 核黄素 悬浮细胞 烟草 抗病性 信号传导 防卫反应
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


核黄素（维生素B2）是一种水溶性B族维生素。核黄素的基本生物功能是以单核苷酸（FMN）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式作为辅酶,参与动植物和微生物的以氧化-还原反应为特征的多个生理生化过程。一些研究表明对多种植物体外使用核黄素,可以促进植物生长、提高作物产量和诱导植物对一些病害的抗性,启动抗病信号通路。目前对于核黄素激活的防卫反应和调节机制还缺乏系统研究。本研究以核黄素作为激发子,以烟草悬浮细胞和烟草幼苗为研究体系,通过生物化学、细胞化学、半定量RT-PCR（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）和高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）等方法测定了一系列防卫反应和对烟草两种重要土传病害的诱导作用。所得结果如下:1.用1 mmol·L-1核黄素处理烟草悬浮细胞,测定了氧化迸发和培养介质碱性化的变化。结果表明1 mmol·L-1核黄素处理悬浮细胞后,产生了氧化迸发和培养介质碱性化。氧化迸发在诱导后5 min产生,1 h时达到最大值;而胞外培养基随诱导时间延长其pH值逐渐升高,当诱导80 min时pH值提高了0.57。说明核黄素可以激活烟草悬浮细胞这些常见早期反应。为了说明钙信号和蛋白磷酸化对这些早期反应的影响,用钙离子通道抑制剂LaCl3、钙离子螯合剂EGTA和一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂staurosporine处理细胞,测定了防卫反应被抑制的情况。结果显示这些早期反应可以被LaCl3、EGTA和staurosporine不同程度地抑制,说明在信号转导中钙信号和蛋白磷酸化参与了这一过程。2.为了阐明核黄素是否诱导烟草悬浮细胞防卫基因的表达,我们通过半定量RT-PCR方法测定了4种防卫基因PR（ pathogenesis-related）-1a、PR-1b、PAL（phenylalanine ammonia lyase）和LPO（lignin peroxidase）的表达情况。结果显示2个PR基因在诱导后的6 h表达量即达到最大水平,PAL和LPO基因的表达启动较慢,在诱导后的6 h表达水平才有明显变化,至24 h表达量达到最高水平。为了阐明核黄素对烟草细胞苯丙氨酸解氨酶（ phenylalanineammonia-lyase, PAL）、过氧化物酶（peroxidase, POD）活性以及抗病相关的酚类物质、木质素等次生代谢产物含量的影响,分别测定一系列与防卫相关的生理和生化指标。结果表明核黄素处理后PAL和POD活性明显升高,处理12 h和24 h后酶活性分别达到峰值;荧光观察细胞壁积累了更多的酚类物质,核黄素处理后的24 h和48 h,烟草悬浮细胞总酚含量分别比对照提高了1.2和1.5倍;胞内和胞外scopoletin（7-羟基-6-甲氧基香豆素）含量明显升高,在处理12 h后都达到峰值,分别是对照的3.6和3.9倍;木质素染色和含量测定表明核黄素处理后烟草悬浮细胞沉积了更多的木质素,处理24 h和48 h后,木质素含量分别为对照的1.5和1.8倍。说明核黄素提高了烟草悬浮细胞PAL、POD活性,积累了更多的与抗病有关的次生代谢产物。3.用核黄素喷雾处理烟草幼苗,测定了不同烟草品种（系）根部接种烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）和青枯病菌（Ralstonia solanacearu）发病后的病情指数,以及青枯细菌在烟草组织内的群体数量变化。结果表明,7个烟苗品种（系）经核黄素处理后两种病害的病情指数有不同程度降低,对卵菌和细菌两种病原的诱导效果最高分别达到70.9%和52.4%,烟草叶片经处理后烟草根部细菌能明显被抑制,说明核黄素提高了烟草对两种土传病害的抗性。

全文目录


摘要  9-11
英文摘要  11-14
研究的目的和意义  14-15
第一部分 文献综述  15-35
  第一章 植物诱导抗病性及其分子机制  15-32
    1 植物诱导抗病性的种类及产生过程  15-16
    2 植物抗病防卫信号传导分子机制  16-28
      2.1 激发子  16
      2.2 受体及信号识别  16-17
      2.3 信号转导  17-24
        2.3.1 蛋白质可逆磷酸化  18-19
        2.3.2 离子流、膜的去极化和Ca~(2+)信号  19-20
        2.3.3 细胞胞外介质碱性化作用  20-21
        2.3.4 活性氧迸发  21-24
      2.4 胞外信号分子：水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号分子  24-28
        2.4.1 水杨酸介导的抗病信号传导途径  24-25
        2.4.2 茉莉酸和乙烯介导的抗病信号传导途径  25-26
        2.4.3 两条抗病信号传导途径间的关系  26-28
    3 防御酶系与诱导抗病性的关系  28-29
    4 次生代谢产物与诱导抗病性的关系  29-32
      4.1 木质素积累  29-30
      4.2 植物保卫素的积累  30-32
  第二章 核黄素在植物抗病防卫信号传导中的作用  32-35
    1 核黄素及其生物功能  32
    2 核黄素在植物抗病防卫信号传导中的作用  32-35
      2.1 核黄素是一个诱导抗病的激发子  32-33
      2.2 核黄素启动的信号传导过程  33
      2.3 核黄素介入植物抗病传导的可能过程  33-35
第二部分 研究内容  35-68
  第一章 核黄素激活烟草悬浮细胞活性氧的产生和培养介质碱性化  35-45
    1 引言  35
    2 材料与方法  35-38
      2.1 试剂  35-36
      2.2 烟草悬浮细胞培养和诱导处理  36-37
        2.2.1 MS培养基的母液配制  36-37
        2.2.2 烟草悬浮细胞培养和诱导处理  37
      2.3 烟草细胞死亡率及烟草叶片过敏性反应测定  37-38
      2.4 活性氧（H_2O_2）含量测定  38
        2.4.1 Scopoletin 贮存液的配制  38
        2.4.2 烟草悬浮细胞中 H_2O_2 含量的测定  38
      2.5 悬浮细胞胞外介质碱性化测定  38
    3 结果与分析  38-42
      3.1 不同浓度核黄素对 H_2O_2 产生的影响  38-39
      3.2 细胞死亡率及叶片过敏性反应测定  39-40
      3.3 核黄素激发烟草细胞氧化突发和不同抑制剂对其影响  40-41
      3.4 核黄素诱导烟草悬浮细胞胞外碱性化和抑制剂的影响  41-42
    4 结论与讨论  42-45
  第二章 核黄素诱导烟草悬浮细胞防卫基因表达及次生代谢物质产生  45-60
    1 引言  45-46
    2 材料与方法  46-50
      2.1 试剂  46
      2.2 烟草悬浮细胞的培养和诱导处理  46
      2.3 烟草悬浮细胞总 RNA 的提取  46-48
        2.3.1 RNA 纯度测定  47
        2.3.2 防卫相关基因的 RT-PCR 分析  47-48
      2.4 PAL和POD活性测定  48-49
      2.5 酚类物质的荧光观察和含量测定  49
      2.6 Scopoletin含量测定  49-50
      2.7 木质素染色和含量测定  50
    3 结果与分析  50-57
      3.1 核黄素诱导烟草悬浮细胞防卫基因的表达  50-51
      3.2 核黄素诱导烟草悬浮细胞PAL活性变化  51-52
      3.3 核黄素诱导烟草悬浮细胞POD活性变化  52
      3.4 荧光显微镜观察酚类物质的积累和含量测定  52-54
      3.5 Scopoletin 含量变化  54-56
        3.5.1 核黄素诱导烟草细胞胞内和胞外scopoletin 含量变化  54-55
        3.5.2 不同抑制剂对核黄素诱导的烟草细胞scopoletin含量的影响  55-56
      3.6 核黄素诱导烟草悬浮细胞木质素染色和含量变化  56-57
    4 结论与讨论  57-60
  第三章 核黄素对烟草幼苗两种土传病害的诱导抗性  60-68
    1 引言  60-61
    2 材料和方法  61-63
      2.1 供试材料  61
      2.2 烟草幼苗的处理  61
      2.3 烟草黑胫病菌游动孢子悬浮液的制备  61
      2.4 烟草青枯病菌菌悬液的制备  61-62
      2.5 诱导接种和处理  62-63
      2.6 细菌在烟草组织内的群体数量测定  63
    3 结果与分析  63-67
      3.1 核黄素诱导烟草幼苗对黑胫病菌的抗性  63-65
      3.2 核黄素诱导烟草幼苗对青枯病菌的抗性  65-67
    4 结论与讨论  67-68
总结与展望  68-70
  1 全文总结  68-69
  2 研究展望  69-70
参考文献  70-83
致谢  83-84
攻读学位期间发表论文情况  84

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 烟草病虫害
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