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胃肠间质瘤差异表达miRNA的筛选研究

作　者: 王翠众
导　师: 沈坤堂
学　校: 复旦大学
专　业: 外科学
关键词: 胃肠间质瘤(GIST) miRNA 基因芯片 RT-PCR
分类号: R735
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的：微小RNA (microRNAs, miRNAs)是一类长约22nt的内源性非编码RNA,在转录后水平调控靶基因mRNA。越来越多的研究证实miRNA在肿瘤的发生、侵袭、转移、耐药等过程中起着重要的作用。但是关于GIST在miRNA的研究还比较少,本课题为了探讨miRNA在GIST发展和耐药过程中的作用,采用基因芯片检测了耐药组、恶性组和交界组GIST中miRNA的表达情况,筛选出不同组别间差异表达的miRNA,并利用实时荧光定量PCR (real-time PCR)技术在30个扩大样本中来验证芯片结果的准确性,再通过生物信息学预测和分析靶基因,总结出miRNA与GIST的内在联系。方法：收集了10例胃肠间质瘤标本,根据病史及术后的病理诊断分为三组,耐药组4例,恶性组3例,交界组3例。抽提总RNA后,利用Agilent人microRNA寡核苷酸基因芯片V3(955个已知的miRNA)进行检测,建立GIST的miRNA基因表达谱,筛选出不同组别差异表达的miRNA。选取耐药组与恶性组之间3个、恶性组与交界组之间4个差异表达最明显的miRNA,利用实时荧光定量PCR (real-time PCR)技术,在30个扩大样本中进行验证,证实了其中3个差异表达的miRNA。利用PicTar、Targetscan、miRanda等生物数据库预测这止匕miRNA的靶基因,从这些靶基因中找出可能与肿瘤相关的基因。运用KEGG数据库分析靶基因在信号通路中的作用,总结出与GIST发生、发展和耐药相关的miRNA及其调控机制。结果：1.基因芯片的结果：耐药组与恶性组相比,相差倍数2倍以上,且p值小于0.05的差异表达miRNA有13个,上调的有5个,分别为hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-335、hsa-miR-151-5p;下调的有8个,分别为hsa-miR-1280、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-135b、hsa-miR-664*、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-574-3p。其中差异最明显,即P值最小的有3个,分别为hsa-miR-15a、hsa-miR-1280、hsa-miR-320a,前者在耐药组中上调,后两者下调；恶性组与交界组相比较,p值小于0.05且相差倍数2倍以上的差异表达miRNA有14个,上调的有5个,分别为hsa-miR-720、hsa-miR-221、hsa-miR-130b; hsa-miR-10b、hsa-miR-135b;下调有9个,分别为hsa-miR-326、hsa-miR-24-1*、hsa-miR-145、hsa-miR-488、hsa-miR-218、hsa-miR-34a、hsa-miR-675*、hsa-miR-335、hsa-miR-505。其中差异最明显,即P值最小的有4个miRNA,分别为hsa-miR-221、hsa-miR-135b、hsa-miR-675*、hsa-miR-218,前两者在恶性组中上调,后两者下调。2. RT-PCR结果：在30个样本中用实时荧光定量PCR对基因芯片筛选出的7个差异最明显的miRNA进行验证,其中3个miRNA得到验证,分别为miR-320a、miR-221和miR-675。并且差异倍数与基因芯片的结果基本相符。3.生物信息学结果：miR-15a、miR-1280、miR-221、miR-218和miR-675可能与GIST的发生、发展有关,相关靶基因可能为c-kit、PDGFRA、CD34、EGFR、PTEN、CCND和CDKN等；miR-15a、miR-320a、miR-675可能与GIST对伊马替尼的耐药性有关。相关靶基因为ABCA、ABCC和bcl-2等。结论：1.筛选出了耐药病灶与恶性病灶之间13个差异表达的miRNA,其中3个差异最明显；恶性病灶与交界性病灶之间14个差异表达的miRNA。其中4个差异最明显。2.采用实时荧光定量PCR技术,验证了其中3个差异表达最明显的miRNA,与基因芯片结果基本相符。3.预测了7个miRNA的靶基因,筛查出与GIST相关的靶基因,总结出了与GIST发生、发展及耐药有潜在联系的miRNA及其作用机制。

胃肠间质瘤差异表达miRNA的筛选研究

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