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金丝慈竹AtCRN1同源基因BeCRN1的分离及遗传转化研究

作　者: 曹慧敏
导　师: 丁雨龙
学　校: 南京林业大学
专　业: 植物学
关键词: 金丝慈竹克隆 BeCRN1 RACE 愈伤组织
分类号: Q785
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 37次
引　用: 1次
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内容摘要

为了研究AtCRN1同源基因BeCRN1的功能并建立金丝慈竹遗传转化体系,本实验选用金丝慈竹作为原材料,进行以下各项研究:采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,在金丝慈竹叶片中分离得到BeCRN1;对BeCRN1进行生物信息学分析;植物双元表达载体pCHF3-BeCRN1构建与导入;采用组织化学法对金丝慈竹愈伤组织进行GUS基因瞬时表达检测金丝慈竹;愈伤组织的抗生素敏感性测试。结果表明:（1）所获得的cDNA全长为1646bp,带一短poly（A）尾巴。该cDNA包含1473bp长的开放阅读框（ORF）,编码一个含有491个氨基酸残基的多肽,含有长度45bp的5′UTR和128bp 3′UTR。（2）NCBI BLAST序列分析表明,BeCRN1与水稻中的相关蛋白（EEC80574.1）一致性和相似性最高,分别为414/487 （85%）和446/487 （91%）。与拟南芥中的CRN1蛋白（NP₁96884.1）一致性为59%,相似性为75%。（3）构建了植物双元表达载体pCHF3-BeCRN1,并采用冻融法导入农杆菌GV3101工程菌中,为以后验证BeCRN1基因的功能奠定了基础。（4）采用组织化学法进行GUS基因瞬时表达检测表明,金丝慈竹愈伤组织可能有β-葡萄糖苷酸酶的本底活性,所以不适合利用本法进行筛选。（5）金丝慈竹愈伤组织的抗生素敏感性测试表明,卡那霉素、PPT和潮霉素都不适用于金丝慈竹抗性愈伤组织筛选。

全文目录

致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-9
第一章引言  9-21
  1 植物的衰老  9-14
    1.1 叶片衰老与叶绿素降解  9-11
    1.2 叶绿素降解与滞绿  11-12
    1.3 叶绿素降解代谢相关基因  12-13
    1.4 AtCRN1 研究进展  13-14
  2 RACE 技术概述  14-19
    2.1 3’RACE 的原理  14-15
    2.2 5’RACE 的原理  15-18
      2.2.1 环化法  15
      2.2.2 末端脱氧核糖核酸转移酶法  15-17
      2.2.3 SMART 反转录酶法  17-18
    2.3 RACE 技术应用现状  18-19
  3 竹类植物转基因技术研究现状  19
  4 研究目的和意义  19-21
第二章 AtCRN1 同源基因BeCRN1 的分离  21-39
  1 材料和试剂  21
    1.1 植物材料  21
    1.2 菌种与载体  21
    1.3 细菌培养基  21
    1.4 生物试剂  21
  2 实验内容与方法  21-31
    2.1 金丝慈竹RNA 提取、检测以及定量  21-22
      2.1.1 RNA 的提取  21-22
      2.1.2 RNA 质量检测  22
      2.1.3 RNA 定量  22
    2.2 用RT-PCR 方法获得 BeCRN1 基因三段保守片段  22-26
      2.2.1 cDNA 第一链合成和反转录 PCR（RT-PCR）  22-23
      2.2.2 BeCRN1 基因三段保守片段的获得  23-26
    2.3 用RACE 法扩增 BeCRN1 基因的3’末端序列  26-28
      2.3.1 3’RACE ready cDNA 的合成  27
      2.3.2 BeCRN1 3’端扩增的 PCR 体系  27-28
    2.4 用RACE 法扩增 BeCRN1 基因的5’末端序列  28-30
      2.4.1 第一链cDNA 的合成  29
      2.4.2 Hybrid RNA 的分解  29
      2.4.3 连接反应  29
      2.4.4 两轮 PCR 扩增  29-30
    2.5 cDNA 全长克隆  30-31
  3 实验结果与讨论  31-39
    3.1 引物寻找结果  31-32
    3.2 金丝慈竹叶片总RNA 提取  32-33
      3.2.1 RNA 质量检测结果  32-33
      3.2.2 RNA 定量结果  33
    3.3 BeCRN1 基因全长cDNA 序列的获得  33-39
      3.3.1 三段保守序列的获得  33
      3.3.2 3’RACE 结果  33-35
      3.3.3 5’RACE 结果  35-36
      3.3.4 全长序列的获得  36-39
第三章 BeCRN1 基因和蛋白序列的生物信息学分析  39-44
  1 研究方法和内容  39
  2 研究结果与讨论  39-44
    2.1 BeCRN1 一级结构序列分析  39-40
    2.2 BeCRN1 的亚细胞定位  40-41
    2.3 BeCRN1 的多序列比对  41-42
    2.4 BeCRN1 的系统进化树分析  42-44
第四章植物表达载体pCHF3-BeCRN1 的构建  44-48
  1 材料与试剂  44
    1.1 菌株和质粒  44
    1.2 培养基  44
    1.3 主要试剂  44
  2 实验内容与方法  44-47
    2.1 植物表达载体pCHF3- BeCRNI 的构建  44-46
      2.1.1 质粒pCHF3 的抽提  44-45
      2.1.2 酶切质粒并回收大片段  45
      2.1.3 带酶切位点的目的片段 BeCRN1 的获得  45
      2.1.4 表达载体pCHF3- BeCRN1 的构建  45-46
      2.1.5 将表达载体pCHF3- BeCRN1 转入 Top10 菌株  46
    2.2 植物表达载体pCHF3-BeCRN1 转化 GV3101  46-47
      2.2.1 农杆菌感受态制备  46
      2.2.2 冻融法转化 GV3101  46-47
  3 实验结果  47-48
第五章金丝慈竹遗传转化初步研究  48-54
  1 实验材料和试剂  48-49
    1.1 植物材料  48
    1.2 菌株和质粒  48
    1.3 实验所用培养基  48-49
    1.4 实验所用试剂  49
  2 实验内容和方法  49-50
    2.1 金丝慈竹遗传转化体系的建立  49
      2.1.1 愈伤组织的诱导  49
      2.1.2 愈伤组织的增殖  49
    2.2 农杆菌LBA4404 浸染液的制备  49-50
    2.3 农杆菌浸染金丝慈竹愈伤和共培养  50
    2.4 GUS 基因表达的组织化学法检测  50
    2.5 愈伤组织对不同抗生素的敏感性测试  50
  3 实验结果与讨论  50-54
    3.1 农杆菌侵染结果  50-51
    3.2 抗生素敏感性测试结果  51-54
第六章总结及展望  54-55
  1 结论  54
  2 论文不足之处  54
  3 展望  54-55
附录  55-56
参考文献  56-61
详细摘要  61-64

金丝慈竹AtCRN1同源基因BeCRN1的分离及遗传转化研究

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