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抗性和敏感小菜蛾（Plutella xylostella）及菜蛾啮小蜂（Oomyzus sokolowskii）ace1基因克隆与序列分析

作　者: 李长伟
导　师: 吴刚
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 抗性敏感小菜蛾菜蛾啮小蜂 ace1 克隆
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase , AChE,EC3.1.1.7.)是昆虫神经传导中的一种关键酶,在神经传导中起着重要的功能,在胆碱能神经突触间,通过催化神经递质乙酰胆碱(acetylcholine, ATCh)来维持神经冲动的正常传递。AChE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。小菜蛾是重大害虫,也是重要的模式昆虫,研究小菜蛾的AChE基因,不仅有助于探讨昆虫对杀虫剂抗性机制,也有助于为开发对害虫高效而对环境没有污染的新型药剂提供科学依据,并指导害虫抗性治理决策。本研究主要研究温度对小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因(ace1)频率的影响及抗性、敏感菜蛾啮小蜂ace1基因部分序列及其氨基酸结构改变与抗药性的关系。根据报道的小菜蛾ace1突变位点,设计bi-PASA检测引物,分别检测高温和常温处理对抗性、敏感小菜蛾后代ace1。计算出检测样本中ace1不同基因型的比列和ace1基因频率,从分子水平上证明了温度对小菜蛾抗性和敏感小菜蛾后代ace1基因型和ace1频率的影响。菜蛾啮小蜂(Oomyzus sokolowskii)是小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫至蛹期的跨期寄生蜂,是目前报道的小菜蛾主要寄生天敌之一。本研究以菜蛾啮小蜂ace1作为研究对象,分别设计了简并和特异性的引物,首次扩增得到抗性、敏感性菜蛾啮小蜂的ace1基因片段,通过比较抗性、敏感性菜蛾啮小蜂乙酰胆碱酯酶片段发现两个突变位点,并与已报道的其他昆虫、电鳐等生物的乙酰胆碱酯酶序列比较分析,得出有一个突变位点可能与菜蛾啮小蜂抗性有关。本研究的主要结果如下:1.通过比对扩增出的小菜蛾ace1片段序列,得出该序列与已报道的抗丙硫磷小菜蛾ace1序列同源性较高,突变的位点也与报道的一致(G to C)。因此,可以得出本实验中所用材料为抗性小菜蛾。2.bi-PASA检测实验,要求设计四条引物:两条外侧引物(allele-nonspecific-F和allele-nonspecific-R),两条内侧引物(allele-specific-F和allele-specific-R)。allele- specific-F的3’端对应突变型,allele -specific-R的3’端则对应敏感型。外侧引物allele-nonspecific-F和allele-nonspecific-R扩增的片段长度348bp;allele-nonspecific-F和allele -specific-R扩增的片段长度144bp;allele- specific-F和allele-nonspecific-R扩增的片段长度254bp。3.采用bi-PASA技术检测田间小菜蛾F1代成虫G227A突变情况,常温处理F0代作为对照:31.8%突变纯合子、63.6%的杂合子和4.6%的野生型。常温处理的比高温处理的突变纯合子由35.5%降至8.8%,杂合子由61.3 %上升至76.9%,而最明显就是野生型比例由3.2%升高到14.3%。4.常温处理的室内敏感小菜蛾F1代成虫比高温处理的杂合子由32.3%降至30.0%,野生型比例由67.7%升高到70.0%,两种处理中都没有检测到突变纯合子。常温处理F0代作为对照: 33.3%的杂合子和66.7%的野生型,没有检测到突变纯合子。5.常温处理的室内抗性小菜蛾F1代成虫比高温处理的突变纯合子由62.5 %降至22.6%,杂合子比例由37.5%升高到61.3%,常温处理中都没有检测到野生型,而高温处理后F1代中野生型占到16.1%。常温处理F0代作为对照: 68.4%的突变纯合子,32.6%的杂合子,没有检测到野生型。6.计算温度处理抗性和敏感小菜蛾F1代成虫ace1基因频率,常温(25.0℃)处理的田间小菜蛾与高温处理的比较,抗性基因(R)的基因频率从66.1%降至47.1%,敏感基因(S)的基因频率则从33.9%升至52.9%。对于室内筛选敏感小菜蛾(经过相同处理)抗性基因(R)的基因频率从16.1%降至15.0%,敏感基因(S)的基因频率则从83.9%升至85.0%,而室内筛选抗性小菜蛾抗性基因(R)的基因频率从81.3%降至53.2%,敏感基因(S)的基因频率则从18.7%升至46.8%。对比常温处理的抗性、敏感小菜蛾F0代,高温处理后抗性基因(R)的基因频率都降低。7.得到的抗性、敏感菜蛾啮小蜂的ace1序列和其他昆虫、电鳐等生物的乙酰胆碱酯酶氨基酸序列进行比对分析,有分析结果证明了我们克隆到的是ace1基因序列。并发现两个突变位点即:Phe272Leu(TTT to CTT)、Lys303Arg(AAG to AGG)。通过与其他昆虫比较分析,可知Phe272Leu(TTT to CTT)和菜蛾啮小蜂抗药性有关,根据AChE结构分析可知,Phe272Leu(TTT to CTT)位于酰基口袋口附近。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-12
第一章文献综述  12-26
  1 乙酰胆碱酯酶的结构和生理功能  12-14
    1.1 乙酰胆碱酯酶的结构  12-13
    1.2 乙酰胆碱酯酶的生理功能  13-14
  2 昆虫乙酰胆碱酯酶基因研究进展  14-19
    2.1 昆虫乙酰胆碱酯酶基因类型  14-17
    2.2 乙酰胆碱酯酶基因与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性  17
    2.3 小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因突变与抗药性关系  17-19
  3 乙酰胆碱酯酶基因突变检测技术  19-21
    3.1 bi-PASA 技术原理  19-20
    3.2 bi-PASA 技术特点及应用  20-21
  4 菜蛾啮小蜂的生物学及其抗药性研究进展  21-23
    4.1 菜蛾啮小蜂的生物学  21-22
    4.2 寄生蜂抗药性研究进展  22-23
  5 技术路线  23-25
    5.1 小菜蛾ace 基因频率检测主要技术路线  23-24
    5.2 两种类型菜蛾啮小蜂ace 克隆  24-25
  6 研究背景、内容及目的意义  25-26
第二章温度对抗性和敏感小菜蛾ace1 频率的影响  26-37
  1 材料与方法  26-30
    1.1 实验材料  26-27
      1.1.1 供试昆虫  26
      1.1.2 主要仪器  26-27
      1.1.3 供试试剂  27
        1.1.3.1 主要试剂  27
        1.1.3.2 主要试剂的配制（DNA 提取液）  27
      1.1.4 实验中的引物序列  27
      1.1.5 分析软件  27
    1.2 实验方法  27-30
      1.2.1 小菜蛾(Plutella xylostella)前处理  27
      1.2.2 小菜蛾RNA 提取、逆转录及PCR 扩增  27-29
        1.2.2.1 小菜蛾RNA 提取  27-28
        1.2.2.2 cDNA 合成  28-29
        1.2.2.3 PCR 扩增  29
      1.2.3 基因组DNA 提取及PCR 检测  29-30
        1.2.3.1 基因组DNA 提取  29
        1.2.3.2 bi-PASA 检测  29-30
  2 小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因序列与频率检测结果分析  30-35
    2.1 田间抗性小菜蛾ace 片段序列  30
    2.2 田间小菜蛾ace 片段P.x-ace 序列分析  30-31
    2.3 小菜蛾ace 基因频率检测结果分析  31-34
    2.4 小结  34-35
  3 讨论  35-37
第三章抗性和敏感菜蛾啮小蜂ace1 片段克隆及序列分析  37-50
  1 材料与方法  37-42
    1.1 实验材料  37
      1.1.1 供试昆虫  37
      1.1.2 主要仪器  37
      1.1.3 分析软件  37
      1.1.4 主要试剂  37
      1.1.5 实验中的引物  37
    1.2 菜蛾啮小蜂RNA 提取、逆转录及PCR 扩增  37-42
      1.2.1 菜蛾啮小蜂总RNA 提取(TIANGEN 试剂盒法)  37-38
      1.2.2 逆转录合成cDNA  38-39
      1.2.3 抗性菜蛾啮小蜂ace 片段扩增及3’RACE 扩增  39-40
        1.2.3.1 利用简并引物扩增中间片段  39-40
        1.2.3.2 3’RACE 扩增  40
      1.2.4 敏感菜蛾啮小蜂ace 片段扩增及3’RACE 扩增  40-42
        1.2.4.1 敏感菜蛾啮小蜂ace 片段扩增  40-41
        1.2.4.2 3’RACE 扩增  41-42
  2 结果与分析  42-49
    2.1 抗性菜蛾啮小蜂ace 序列的结果与分析  42-44
      2.1.1 抗性菜蛾啮小蜂简并引物扩增结果分析  42-43
      2.1.2 3’RACE 结果分析  43-44
    2.2 敏感菜蛾啮小蜂ace 序列结果与分析  44-46
      2.2.1 敏感菜蛾啮小蜂ace 特异序列结果与分析  44-45
      2.2.2 3’RACE 结果分析  45
      2.2.3 两段序列（OS –ace51 和OS –ace52）拼接序列分析  45-46
    2.3 菜蛾啮小蜂乙酰胆碱酯酶与其他物种的比对分析  46-48
    2.4 小结  48-49
  3 讨论  49-50
参考文献  50-54
致谢  54

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