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烟草全长cDNA文库的构建及初步分析

作　者: 郭艳
导　师: 庄伟建
学　校: 福建农林大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 烟草 各组织 环境胁迫 全长文库构建
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


我国是一个烟草大国,烟草和卷烟产量均居世界首位,烟草业在我国国民经济中占有重要的地位。烟草作为高附加值的经济作物,其行业税收在我国国民经济中一直以来占有重要的地位。病虫害和各种恶劣环境是造成烟草减产降质的主要因素,提高烟草的烟叶品质,培育抗病、虫和抗逆的烟草品种是解决烟草生产问题的关键。随着功能基因组学和生物技术的迅猛发展,克隆和鉴定各种抗性、品质基因,利用基因工程技术迅速高效培育各种高产优质和抗耐胁迫新品种,已成为未来解决农业生产问题的重要技术。为发掘各种影响烟草抗性、品质和具有调控功能的功能基因,为烟草分子育种奠定基础,我们采用SMART技术分别构建了烟草翠碧1号不同组织和不同处理的两个混合全长cDNA文库,用于抗病、抗逆基因和品质基因的分离和功能研究,具体研究结果如下。为分离烟草器官发育特异功能基因和品质形成相关的重要功能基因,分别取烟草幼苗全组织,烟草根、茎、叶、花序和果实发育不同时期的组织器官,分别提取各器官的RNA,得到了高质量的各组织总RNA,等量混合提取mRNA,利用SMART技术成功构建了烟草各组织器官混合的全长cDNA文库。初级文库包含2×106cfu/ml,重组率为100%,插入片段分布于800～2000bp之间,扩增文库的滴度约为1.0×1012cfu/ml。从文库中随机挑选10个单克隆,进行两端测序,结果表明, 10个基因中全长基因占5个,全长率为50%,且10个序列均与登录在NCBI上的核酸数据库中的核酸序列存在显著的相似性。其中有2个与推测的、假想的蛋白质序列有相似性,6个与功能已知的蛋白质序列显著同源,说明可以用于筛选所需要的功能基因。为了分离烟草各种抗病、抗逆等功能基因,分别对烟草翠碧一号植株进行了SA、ABA、ethylene和低温、干旱等非生物胁迫处理,取处理后不同时期的叶片和/或根材料,分别提取各种处理的RNA,混合提纯得到了高质量的mRNA。用同样的SMART技术构建了受不同胁迫诱导的烟草混合全长cDNA文库。所得到初级文库包含2.4×106个克隆,扩增文库滴度为1.1×1012cfu/ml。随机挑取23个克隆用PCR鉴定重组子,发现重组率接近96 %,插入片段集中分布在750～2000bp。随机挑取10个克隆进行双向测序,结果10个基因有8个属烟草基因,另两个与马铃薯的未知基因和苜蓿的假设基因类似,10个基因序列均大于900bp,有5个是全长基因。说明所构建的文库达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章 引言  11-29
  1 植物功能基因组学研究进展  11-15
    1.1 植物功能基因组学主要研究内容  11
    1.2 植物功能基因组学研究技术与方法  11-13
    1.3 植物功能基因组学研究现状与发展趋势  13-14
    1.4 烟草基因组学研究现状  14-15
  2 逆境诱导相关基因研究进展  15-19
    2.1 植物应答干旱胁迫基因研究  15-16
    2.2 低温诱导相关基因的研究  16-19
  3 激素诱导植物抗病性机制的研究进展  19-22
    3.1 水杨酸诱导植物抗病性机制  19-20
    3.2 ABA诱导植物抗病性研究  20-21
    3.3 乙烯诱导植物抗病性研究  21-22
  4 植物全长 cDNA 文库构建原理及应用现状  22-25
    4.1 全长cDNA文库的特点  22
    4.2 构建全长cDNA文库的方法与原理  22-24
    4.3 重要生物全长cDNA文库克隆与测序研究进展  24-25
  5 生物信息学研究进展  25-28
    5.1 生物信息学的产生背景  25-26
    5.2 生物信息学研究内容  26-27
    5.3 生物信息学研究现状与展望  27-28
  6 本实验研究的目的与意义  28-29
第二章 烟草翠碧 1 号各种组织混合全长文库的构建及分析  29-48
  1 材料与方法  29-39
    1.1 材料  29-30
    1.2 方法  30-39
  2 结果与分析  39-44
    2.1 构建了烟草各种组织全长 cDNA 文库  39-43
    2.2 所构建文库质量分析  43-44
  3 讨论  44-48
    3.1 关于烟草各种组织总 RNA 的提取  44
    3.2 烟草各种组织全长文库构建原理和利用评价  44-48
第三章 烟草翠碧 1 号各种处理混合全长 cDNA 文库的构建及分析  48-59
  1 材料与方法  48-51
    1.1 材料  48
    1.2 方法  48-51
  2 结果与分析  51-56
    2.1 构建了烟草各处理全长混合文库  51-55
    2.2 所构建文库质量分析  55-56
  3 讨论  56-59
    3.1 构建全长文库是克隆全长表达基因有效途径  56-57
    3.2 关于如何提高全长cDNA 文库的构建质量  57-59
参考文献  59-66
附录：载体图  66-67
致谢  67

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 烟草（菸草）
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