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实时荧光定量PCR检测NPM1基因突变及表达的方法学构建与临床应用

作　者: 马瑀
导　师: 张继红
学　校: 中国医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 急性髓系白血病核仁磷酸蛋白基因突变实时荧光定量聚合酶链反应
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一组在临床及遗传学上均高度异质性的疾病,细胞遗传学和分子遗传学是影响AML患者预后最重要的独立因素。常规染色体检查中50%～60%的成人原发AML患者的治疗前骨髓中可检出获得性重现性染色体异常（10%～20%为复杂核型）,即FAB分型中t（15;17）、t（8;21）和inv（16）/t（16;16）等,与之对应的融合基因成为国际上公认监测微小残留病灶（minimal residual disease,MRD）的指标。而另外40%～50%的患者在细胞遗传学上呈现为核型正常,属中等预后组,这群在AML预后分组中所占比例最大的患者预后变异较大,是否真的不存在遗传学异常,还是常规的检测手段不能发现问题,寻找有助于进行核型正常AML患者预后分级的分子标志成为当今国际上的研究热点。NPM1（Nucleophosmin,又称B23或N038）是一类穿梭于核仁、核质和胞质的蛋白质,通过与肿瘤抑制因子ARF相互作用,参与P53活性和细胞周期的调节,保持基因组的稳定。近年来发现,除M3外大约46%～62%核型正常的AML中存在核磷酸蛋白NPM1基因第12号外显子的突变及其蛋白的胞浆移位,提示NPM1突变在急性髓系白血病的发生、诊断及疗效监测等方面具有重要意义。本研究以初诊患者作为研究对象,构建应用实时荧光定量PCR技术定量检测NPM1—A型突变（NPM1-mutA）的方法,检测NPM1-mutA在142例初诊成人AML患者中的发生率,观察其mRNA表达水平与细胞形态学,细胞遗传学,免疫表型等临床特征的关系,初步探讨其作为监测白血病MRD指标的可行性及其在核型正常AML患者的临床诊断、预后分级等方面的潜在应用价值与意义。方法1、实时荧光定量PCR检测NPM1—mutA mRNA表达量的方法构建:采用相对定量法,应用TaqMan探针技术,以管家基因ABL为内参,同时设置正常对照和无模板对照;提取待测标本总RNA,测定其核酸浓度,进行10倍系列稀释后作为反应模板,设定其拷贝数为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶构建标准曲线;反应结束后,设定最佳阈值,荧光定量PCR仪给出曲线斜率及Ct值,计算目的基因的相对表达指数,同时对方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。2、对142例初诊为AML的成人患者骨髓标本进行FAB细胞形态学分型,常规染色体核型分析及流式细胞术检测其免疫分型。骨髓增生异常综合症（MDS）和继发性AML均不作为入选对象,10名健康捐献者骨髓标本作为对照。3、提取AML及健康者骨髓标本总RNA,逆转录为cDNA进行实时荧光定量PCR检测,应用逆转录PCR对定量PCR扩增产物进行确认。定量检测结果参照标准曲线,得到NPM1—mutA mRNA的相对表达指数。4、观察并分析NPM1—mutA mRNA的表达水平与AML患者FAB分型、白细胞数量及CD34表达的关系。5、常规进行方差齐性检验、正态性检验。单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差不齐者采用非参数检验,计数资料使用卡方检验,以P＜0.05为差别有统计学意义。采用SPSS12.0统计软件处理分析。结果1、实时荧光定量PCR检测NPM1-mutA的表达量:扩增反应的循环阈值（Cyclethreshold,Ct）与起始模板拷贝数的对数存在良好的线性关系（相关系数r=0.9963）,测量范围达1×10^-6数量级,且重复性好,管间、批间变异系数（coefficient variation,CV）分别为1.8%、2.1%。2、142例初诊成人AML患者中NPM1基因第12号外显子的突变检出率为21.8%（31/142）;在M0中占50.0%（1/2）、M1中占25.0%（1/4）、M2中占21.7%（10/46）、M3中占0%（0/44）、M4中占41.7%（10/24）、M5中占47.1%（8/17）、M6中占20.0%（1/5）。3、64例正常核型AML中NPM1-mutA阳性患者占45.3%（29/64）,78例异常核型AML中检出2例伴有NPM1-mutA（2.6%）。正常核型AML患者NPM1-mutA的比例高于异常核型组（P＜0.05）。4、NPM1-mutA阳性患者具有外周血白细胞高（P＜0.05）,CD34表达低的临床特征（P＜0.05）。结论1、成功构建了实时荧光定量PCR检测AML患者NPM-mutAmRNA表达水平的方法。2、成人AML尤其是正常核型的AML患者中NPM1基因第12外显子突变发生率高,是目前常见的分子遗传学异常之一。3、NPM1-mutA的检出率在AML各FAB分型中存在显著差异,FABM4和M5患者更为多见。NPM1-mutA突变患者具有高白细胞数、CD34表达水平低等临床特征。4、NPM基因表达水平有可以做为核型正常的AML监测微小残留病变的指标之一。5、应用实时荧光定量PCR检测NPM1基因突变的方法简单可靠,易于在临床开展,有助于初诊AML患者的辅助诊断及预后监测。

全文目录

一、摘要  4-10
  中文论著摘要  4-7
  英文论著摘要  7-10
二、英文缩略语  10-11
三、论文  11-24
  前言  11-12
  材料与方法  12-16
  实验结果  16-20
  讨论  20-23
  结论  23-24
四、本研究创新性的自我评价  24-25
五、参考文献  25-27
六、附录  27-42
  综述  27-41
  致谢  41-42
  个人简介  42

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